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【作 者】鄭溜豐

【學(xué)位授予單位】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

【學(xué)位名稱】博士

【導(dǎo)師姓名】彭健

【學(xué)位年度】2017

【關(guān)鍵詞】仔豬；低蛋白日糧；支鏈氨基酸；采食量；骨骼肌生長(zhǎng)；蛋白質(zhì)合成與降解；氨基酸代謝

【摘 要】

充足的底物濃度和平衡的氨基酸模式是豬骨骼肌高效蛋白質(zhì)合成的必要條件。其中,采食量是保障充足的底物濃度的關(guān)鍵。除作為合成蛋白質(zhì)底物外,支鏈氨基酸（branched chain amino acids,BCAAs）（包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）可能還發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用。比如,纈氨酸能夠調(diào)控豬采食量。此外,幾乎所有谷氨酸和天冬氨酸以及大部分谷氨酰胺在腸道發(fā)生了分解代謝,導(dǎo)致不可逆的損失。骨骼肌蛋白質(zhì)合成所需的這三個(gè)非必需氨基酸必須要由BCAAs代謝生成。而且BCAAs僅有部分被腸道和肝臟等器官截留。因此,通過(guò)日糧中添加BCAAs可能增加骨骼肌內(nèi)自身代謝生成谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸,優(yōu)化胞內(nèi)氨基酸模式,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。目前已有的研究表明,日糧添加BCAAs可以提高豬生長(zhǎng)性能,但其對(duì)采食量及骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。

本研究圍繞BCAAs提高仔豬采食及骨骼肌生長(zhǎng)的關(guān)鍵問(wèn)題,通過(guò)兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)了低蛋白日糧添加BCAAs通過(guò)提高采食量和直接促進(jìn)肌肉生長(zhǎng),改善仔豬生長(zhǎng)性能,并進(jìn)一步闡明了下丘腦感應(yīng)BCAAs調(diào)節(jié)仔豬采食量的機(jī)制。應(yīng)用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù),研究了日糧BCAAs對(duì)攝食狀態(tài)下骨骼肌的氨基酸凈利用及代謝的影響,并探究了BCAAs代謝與肌肉氨基酸凈利用的關(guān)系;應(yīng)用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù),進(jìn)一步闡明了BCAAs通過(guò)自身代謝調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)合成的機(jī)制。最后研究了日糧BCAAs對(duì)禁食狀態(tài)下骨骼肌內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解的信號(hào)通路活性的影響。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:

第一部分:通過(guò)兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)研究了低蛋白日糧添加BCAAs對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、采食量及骨骼肌生長(zhǎng)的影響。

在試驗(yàn)一中,選取28頭斷奶仔豬分為4個(gè)組,即正對(duì)照組、負(fù)對(duì)照組、試驗(yàn)1組以及試驗(yàn)2組,日糧粗蛋白水平依次為19.5%、16.7%、16.7%和17.2%。其中,試驗(yàn)1組在負(fù)對(duì)照組基礎(chǔ)上添加纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸保證日糧中三種BCAAs水平與正對(duì)照組一致,并增加一倍的添加劑量形成試驗(yàn)2組的日糧。自由采食。

試驗(yàn)二為配對(duì)試驗(yàn),選取21頭斷奶仔豬分為3個(gè)組,即負(fù)對(duì)照組、試驗(yàn)1組以及配對(duì)組。其中,負(fù)對(duì)照組和試驗(yàn)1組同試驗(yàn)一。配對(duì)組試豬飼喂試驗(yàn)1組的日糧,但采食量與負(fù)對(duì)照組保持一致。28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)選擇6頭屠宰,測(cè)定胴體性狀,采集下丘腦及背最長(zhǎng)肌樣。同時(shí),剝離背最長(zhǎng)肌等主要的23塊肌肉,分別稱量肌肉塊重量。

主要結(jié)果如下:

1.與負(fù)對(duì)照組相比,試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組顯著提高了平均日增重、末重、采食量、前軀、中軀和后軀肌肉總重、背最長(zhǎng)肌等大多數(shù)肌肉塊重量以及氮沉積（P<><><>

2.與負(fù)對(duì)照組相比,日糧添加BCAAs以劑量依賴的方式上調(diào)下丘腦Agrp和NPY mRNA水平,下調(diào)MC4R mRNA水平,并在試驗(yàn)2組達(dá)到差異顯著水平（P<0.05）。此外,試驗(yàn)1組顯著下調(diào)了cart><0.05）?；貧w分析顯示,采食量隨npy mrna水平增加呈二次曲線增加（p="0.02）,而隨MC4R" mrna水平增加呈線性降低（p="">

3.與負(fù)對(duì)照組相比,試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組顯著降低了下丘腦eIF2α磷酸化水平,以及顯著提高了S6K1磷酸化水平（P<><>

4.與負(fù)對(duì)照組相比,試驗(yàn)1組和配對(duì)組均顯著提高了背最長(zhǎng)肌S6K1和mTOR磷酸化水平（P<>

第二部分:利用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)研究了日糧添加BCAAs對(duì)仔豬肌肉氨基酸凈利用和股靜脈代謝產(chǎn)物譜的影響。試驗(yàn)動(dòng)物同第一部分的配對(duì)試驗(yàn)。28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)負(fù)對(duì)照組及試驗(yàn)1組的試豬分別在股動(dòng)脈、股靜脈、頸動(dòng)脈和頸靜脈安裝插管。在術(shù)后的第5 d,每組各選擇6頭健康且插管通暢的試豬進(jìn)行正式試驗(yàn)。通過(guò)股動(dòng)脈持續(xù)9 h灌注對(duì)氨基馬尿酸（pAH）以測(cè)定肌肉血流速度。每隔1 h飼喂以保持試豬始終處于攝食狀態(tài),連續(xù)飼喂8次。攝食前及攝食后每隔1 h分別采集頸動(dòng)脈和股靜脈血樣以供分析pAH、游離氨基酸及支鏈α酮酸,連續(xù)采集8次。待血樣采集完成后屠宰,采集股二頭肌樣用于游離氨基酸及3-甲基組氨酸分析,股靜脈血樣同時(shí)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

主要結(jié)果如下:

1.肌肉血流速度在攝食后顯著提高了（P<><><><>

2.日糧添加BCAAs顯著提高了總BCAAs、總必需氨基酸、總非必需氨基酸及總氨基酸的肌肉凈利用量（P<><><>

3.日糧添加BCAAs對(duì)股靜脈代謝物有顯著影響,這些差異化合物與BCAAs代謝和蛋白質(zhì)合成相關(guān)。例如,添加BCAAs顯著提高了三種支鏈α酮酸、谷氨酰胺以及天冬酰胺等代謝產(chǎn)物含量（P<><><>

4.肌肉氨基酸凈利用量分別與動(dòng)脈的亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸濃度呈顯著正相關(guān)（P<><>

第三部分:利用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)研究了日糧BCAAs通過(guò)調(diào)控自身代謝影響仔豬骨骼肌蛋白質(zhì)合成與降解的機(jī)制。攝食狀態(tài)下機(jī)制研究的試驗(yàn)動(dòng)物同第二部分試驗(yàn)。在試豬第一次采食完,通過(guò)頸靜脈灌注NaH¹³CO₃,持續(xù)2 h。隨后灌注[1-¹³C]亮氨酸,持續(xù)6 h。pAH灌注以及血樣采集同第二部分試驗(yàn)。血樣用于分析亮氨酸、KIC和CO₂濃度及其同位素豐度。禁食狀態(tài)下機(jī)制研究的試驗(yàn)動(dòng)物同第一部分試驗(yàn)的試驗(yàn)一。采集負(fù)對(duì)照組和試驗(yàn)1組的背最長(zhǎng)肌樣。

主要結(jié)果如下:

1.日糧添加BCAAs顯著提高亮氨酸的動(dòng)脈攝入量和凈利用量（P<><><><>

2.肌肉的[1-¹³C]亮氨酸凈攝取以及[1-¹³C]KIC凈生成在日糧添加BCAAs后也顯著提高了（P<>¹³C]KIC凈生成之間呈顯著正相關(guān)（P<>

3.日糧添加BCAAs顯著提高了背最長(zhǎng)肌的Akt、mTOR及其下游靶蛋白S6K1的磷酸化水平（P<><><>

本研究的主要結(jié)論為:

（1）低蛋白日糧添加BCAAs可以提高采食量以及直接促進(jìn)肌肉生長(zhǎng),從而改善仔豬生長(zhǎng)性能,并能恢復(fù)到飼喂高蛋白日糧的水平;

（2）日糧BCAAs可以通過(guò)影響下丘腦的食欲調(diào)節(jié)基因表達(dá)及通路活性,提高采食量;

（3）日糧BCAAs通過(guò)促進(jìn)自身在肌細(xì)胞內(nèi)的代謝以及蛋白質(zhì)降解,進(jìn)而增加氨基酸凈利用量,提高攝食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)合成速率;同時(shí),日糧BCAAs通過(guò)下調(diào)泛素-蛋白酶體以及自噬-溶酶體途徑的關(guān)鍵蛋白表達(dá),抑制禁食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)降解,并最終提高蛋白質(zhì)沉積,從而促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)。