DDD. 用的是Santa Cruz的抗體，也實(shí)驗(yàn)過一抗和二抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍(lán)染色沒問題，但是不知道與Marker對(duì)應(yīng)的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時(shí)轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細(xì)胞，4度12000g離心5分鐘，取上清，與分子克?。ǖ诙妫┥系募訕觔uffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問題？
解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測(cè)蛋白的濃度，一般來講，其濃度應(yīng)該在幾-20微克/微升。
2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10％和12％的膠。60-80V，1小時(shí)左右。跑過積層膠與分離膠的線時(shí)，換用100V，3-4小時(shí)。
3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時(shí)，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉(zhuǎn)過去的，并不是真正的少，而是因?yàn)樵谔岬牡鞍字写蟮鞍妆旧砭秃苌?。我曾?jīng)也轉(zhuǎn)過2小時(shí)，但和45分鐘的區(qū)別并不大。
4、根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。
5、延長1抗、2抗孵育時(shí)間（我曾室溫1小時(shí)，4度過夜），適當(dāng)加大1抗?jié)舛取?br>6、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他方面的原因。
EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。
解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時(shí)溴酚藍(lán)和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時(shí)間。建議你用恒壓80－100伏。
FFF. BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有一個(gè)很致命的弱點(diǎn)就是無法控溫（我用的就是這種），當(dāng)電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。
就轉(zhuǎn)膜時(shí)，是采取恒壓還是恒流的問題，我想和大家探討一下，我感覺我這個(gè)系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有68cm2，用50mA恒流來轉(zhuǎn)膜，剛開始電壓就很高，有20 v左右，而用恒壓，開始電流有110mA，但15min后，電流就降到8OmA，30min后就穩(wěn)定在40mA，不就相當(dāng)于恒流嗎？
解答：恒流時(shí)電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺，20V的電流30min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過我用的是小膠40cm2，不知有無不同。
GGG. 我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？
解答：不管怎么轉(zhuǎn)都會(huì)存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全（電壓過小時(shí)間過短）或過度轉(zhuǎn)移（電壓過大時(shí)間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，下半時(shí)間短，上半時(shí)間長一點(diǎn)，應(yīng)該會(huì)好一些。
HHH. 請(qǐng)問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。
III. 1、煮好后的樣品，若沒有及時(shí)上樣分離，應(yīng)如何保存，可以保存多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手冊(cè)？3、濕式轉(zhuǎn)移時(shí)是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉(zhuǎn)移的條件如何確定，因?yàn)槲乙蛛x小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個(gè)濃度？書上寫不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個(gè)線形范圍，是不是不在這個(gè)范圍內(nèi)也能分離，只是就不是線性范圍了？
解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們?cè)谝粋€(gè)月后此樣品，效果一樣。
2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊(cè)在他們的主頁Bio-Rad USA上有。
3、轉(zhuǎn)移時(shí)一般的WATERMEN濾紙就可以。
4、轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關(guān)的：以次確定電壓和時(shí)間。具體可讓ptglab幫你定奪。
5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關(guān)。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。
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