?苦參中提取的生物堿在治療支原體、衣原體和真菌引起的疾病中的藥物用途的制作方法
專利名稱：：苦參中提取的生物堿在治療支原體、衣原體和真菌引起的疾病中的藥物用途的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及苦參中提取的生物堿的藥物用途，特別是苦參中提取的生物堿作為活性成分在治療支原體、衣原體和真菌引起的疾病中的藥物用途。
背景技術(shù)：
：支原體是一種不同與細菌和真菌的另一類微小病原體，支原體屬有80余種，與人類有關(guān)的支原體有肺炎支原體(MP)、人型支原體(MH)、解脲支原體(UU)和生殖支原體(MG)，前者引起肺炎，后三者引起泌尿生殖道感染。衣原體是一類能通過細胞濾器，有獨特發(fā)育周期、嚴格細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物。巳知的與人類疾病有關(guān)的衣原體有三種，分別是鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體(CT)和肺炎衣原體(CP)。沙眼衣原體主要是通過性接觸傳播，進入生殖道后，喜歡進入粘膜細胞內(nèi)生長繁殖，在女性引起子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔炎、尿道炎等。在男性可引起尿道炎、附睪炎、直腸炎等炎癥。女性感染沙眼衣原體，會引起不孕、異位妊娠(宮外孕)、流產(chǎn)、死胎、胎膜早破、早產(chǎn)等。支原體、衣原體感染人體后，首先侵入柱狀上皮細胞并在細胞內(nèi)生長繁殖，然后進入單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞內(nèi)增殖。由于支原體、衣原體在細胞內(nèi)繁殖，導致感染細胞死亡，同時尚能逃避宿主免疫防御功能，得到間歇性保護。支原體、衣原體的致病機理是抑制被感染細胞代謝，溶解破壞細胞并導致溶解酶釋放，代謝產(chǎn)物的細胞毒作用，引起變態(tài)反應和自身免疫。非淋菌性尿道炎約有30%~50%的病例由沙眼衣原體引起，10%~30%的病例由解脲支原體引起。支原體、衣原體感染引起的非淋菌性尿道炎(宮頸炎)目前多以干擾蛋白合成類抗生素如四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療，雖有一定療效，但存在耐藥菌株增加、復發(fā)率高、藥物副作用大、用藥依從性差等問題。真菌病由于致病真菌的不同，可分為角質(zhì)癬菌癥、皮膚癬菌病、皮膚和皮下組織真菌病、系統(tǒng)性真菌病和條件致病性真菌病五種。其中以皮膚癬菌病的發(fā)病率最高。而白色念球菌引起的霉菌性陰道炎，是常見的婦科病，孕婦最為常見，近年來發(fā)病率有所增長，有人統(tǒng)計有30~50%的婦女曾患過霉菌性陰道炎，至少75%的婦女在妊娠期患過此病?？鄥opAra^av^ce"s中含有的生物堿，主要為苦參堿(matrine)、氧化苦參堿(oxymatrine)，其次為槐果堿(sophocarpine)、氧化槐果堿(N-oxysophocarpine)、槐定堿(sophoridine)、甲基金雀花堿(methylcytisine)、安那吉堿(anagyrine)、膺靛葉堿(baptifoline)等?？鄥A和氧化苦參堿在藥材中的含量之和在1.2%以上，是苦參抗菌、抗病毒、抗病原蟲、抗腫瘤等作用的主要有效成分，槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿等生物堿在藥材中含量也較為豐富，也是苦參的有效成分。授權(quán)公告號為CN1199674C公開了一種復方苦參潔陰沖洗液，以苦參為主藥，適應癥包括老年性陰道炎、滴蟲性陰道炎、真菌、淋菌、細菌及支原體和衣原體性宮頸炎、陰道潰瘍、絕經(jīng)期陰道干枯等婦女生殖系統(tǒng)疾病。授權(quán)公告號為CN1270742C公開了一種具有抗菌作用的中藥組合物及制備方法。該中藥組合物是由黃芩、黃柏、苦參、金銀花、白頭翁和白花蛇舌草的活性成分提取物與藥用輔料組成的口服制劑。適用于制備治療由支原體、衣原體感染所引起的生殖、泌尿系統(tǒng)疾病的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供從苦參中提取的生物堿作為活性成分在治療支原體、衣原體和真菌引起的疾病中的藥物用途。作為本發(fā)明的苦參中提取的生物堿，是指苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿或苦參總堿的一種或組合。其中苦參總堿中總生物堿含量為70.0wt%99.0wt%，苦參堿和氧化苦參堿的含量為45.0wt%90.0wt%。上述苦參中提取的生物堿的藥物用途是以所述的苦參中提取的生物堿，或是苦參中提取的生物堿制成的藥學上可接受的鹽，加入藥學上可接受的輔料，制成的任何一種劑型的藥物，包括凝膠劑、栓劑、軟膏劑、洗劑、膠囊劑、片劑、注射劑等，治療由支原體和/或衣原體感染引起的肺炎、非淋菌性宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔炎、非淋菌性尿道炎、男性不育、附睪炎、直腸炎等，以及真菌感染引起的念珠菌病、角質(zhì)癬菌癥和皮膚癬菌病等。本發(fā)明中的從中藥苦參中提取的生物堿與化學藥物相比，具有安全、毒副作用小等特點。在本發(fā)明的研究過程中，體外藥效試驗表明對肺炎支原體(MP)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)、微小脲原體(UP)、沙眼衣原體(CT)、肺炎衣原體(CP)、須癬毛癬菌、紫色毛癬菌和白色念珠菌，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿及苦參總堿均有良好的抑制作用。以下結(jié)合體外藥效試驗及結(jié)果對本發(fā)明作進一步描述實驗一苦參中提取的生物堿抗支原體MP、UU、UP和MH的活性研究(一)供試樣品樣品A:苦參堿(20mg/ml)樣品B:氧化苦參堿(20mg/ml)樣品C:槐果堿(20mg/ml)樣品D:氧化槐果堿(20mg/ml)樣品E:槐定堿(20mg/ml)樣品F:苦參總堿(30mg/ml)以上樣品用25mMNaAc:HAc緩沖液或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6左右，與培養(yǎng)基pH保持一致。(二)實驗設計測試菌株肺炎支原體(MP)ATCC15293與MP5、MP7、MPU三株臨床分離株。解脲支原體(UU)ATCC27618與UU12、UU45、UU61三株臨床分離株。人型支原體(MH)ATCC23114與MH2、MH5、MH6三株臨床分離株。微小脲原體(UP)ATCC27815與UP24、UP29、UP32三株臨床分離株。注質(zhì)控菌株來自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)測試方法微量液體稀釋法(菌濃lxl()6個菌/ml)。樣品終濃度與對照(紅霉素作為已知有效藥物對照)濃度孔l孔2孔3孔4孔5孔6孔7孔8A(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156陽性對照陰性對照B(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156陽對陰對C(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156陽對陰對D(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156陽對陰對E(mg/ml)2.51.250.6250.3120.156陽對陰對F(mg/ml)7.53.751.8750.940.470.235陽對陰對紅霉素Og/ml)12562.531.2515.67.33.65陽對陰對每個樣品均做1:2連續(xù)倍量稀釋。陽性對照每排第7孔為培養(yǎng)基加測試菌株。陰性對照每排第8孔為培養(yǎng)基加Buffer。(三)實驗步驟①從第1孔至7孔，每孔加100^1培養(yǎng)基。②每排第8孔，培養(yǎng)基和Buffer各加100^1作為陰性對照。③每排第1孔加送檢樣品100pl，然后倍比稀釋到第6孔棄去100pl。每排第1孔至7孔，各加lOOpl菌液。(四)測試結(jié)果1.對肺炎支原體(MP)ATCC15293與MP5、MP7、MP11三株臨床分離株的作用樣品A的MICso分別是5、5、2.5和1.25mg/ml;B的MICso分別是5、無效、2.5和5mg/ml;C的MIC5G分別是5、無效、無效和2.5mg/ml;D的MIC5Q分別是1.25、5、2.5和5mg/ml;E的MIC5()分別是5、2.5、2.5和5mg/ml;F的MIC5Q均是1.875mg/ml;紅霉素的MlC5。是7.3ng/ml。2.對解脲支原體(UU)ATCC27618與UU12、UU45、UU61三株臨床分離株的作用樣品A的MIC5o分別是5、5、2.5和1.25mg/ml;B的MICso分別是5、5、5和2.5mg/ml;C的MICso分別是5、5、2.5和無效mg/ml;D的MICso分別是5、無效、5和5mg/ml;E的MIC5G分別是5、5、2.5和2.5mg/ml;F的MICso均是1.875mg/ml;紅霉素的MICso是15.625昭/ml。3.對人型支原體(MH)ATCC23114與MH2、MH5、MH6三株臨床分離株的作用樣品A的MICso分別是1.25、2.5、1.25和0.625mg/ml;B的MICso分別是5、2.5、2.5和5mg/ml;C的MICso分別是5、1.25、2.5和5mg/ml:D的MICso分別是2.5、5、2.5和2.5mg/ml;E的MIC5Q分別是5、無效、5和5mg/ml;F的MIC5G分別是0.47、0.47、0.235和0.47mg/ml;紅霉素的MIC5G是37.5昭/ml。4.對微小脲原體(UP)ATCC27815與UP24、UP29、UP32三株臨床分株的作用樣品A的的MIC5o分別是2.5、2.5、2.5和1.25mg/ml;B的MIC50分別是2.5、5、無效和2.5mg/ml;C的MIC5o分別是無效、無效、5禾Q2.5mg/ml;D的MIC5o分別是5、2.5、無效和5mg/ml;E的MICso分別是2.5、2.5、2.5禾H2.5mg/ml;F的MICso分別是0.938、0.47、1.875和0,47mg/ml;紅霉素的MIC50是1.0嗎/ml。(五)結(jié)論本次體外抗支原體效果試驗表明對肺炎支原體(MP)、解脲支原體(UU)、人型支原體(MH)、微小脲原體(UP)，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿及苦參總堿均有良好的抑制作用。實驗二苦參中提取的生物堿抗衣原體CT和CP的活性研究(一)供試樣品樣品A:苦參堿(20mg/ml)樣品B:氧化苦參堿(20mg/ml)樣品C:槐果堿(20mg/ml)樣品D:氧化槐果堿(20mg/ml)樣品E:槐定堿(20mg/ml)樣品F:苦參總堿(30mg/ml)以上樣品用25mMNaAc:HAc緩沖液或氫氧化鈉調(diào)整PH至6左右，與培養(yǎng)基pH保持一致。(二)實驗設計測試菌株沙眼衣原體(CT)ATCCVR1500與CT9、CT15、CT19三株臨床分離株。肺炎衣原體(CP)ATCCVR1435與CP3、CP26、CP31三株臨床分離株。注質(zhì)控菌株來自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)測試方法微量液體稀釋法(菌濃lxl(^個菌/ml)。樣品終濃度與對照(紅霉素作為已知有效藥物對照)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>每個樣品均做1:2連續(xù)倍量稀釋。陽性對照每排第7孔為培養(yǎng)基加測試菌株。陰性對照每排第8孔為培養(yǎng)基加Buffer。(三)實驗步驟①從第1孔至7孔，每孔加100nl培養(yǎng)基。②每排第8孑L培養(yǎng)基和Buffer各加100^1作為陰性對照。③每排第1孔加送檢樣品100^1，然后倍比稀釋到第6孔棄去100nl。每排第1孔至7孔，各加100^1菌液。(四)測試結(jié)果1.對沙眼衣原體(CT)ATCCVR1500與CT9、CT15、CT19三株臨床分離株樣品A的MICsQ分別是2.5、5、1.25和2.5mg/ml;B的MICso分別是5、5、2.5和5mg/ml;C的MICso分別是2.5、5、5和5mg/ml;D的MIC5o分別是1.25、2.5、5和5mg/ml;E的MICso分別是5、2.5、5和2.5mg/ml;F的MIC5Q分別是0.938、1.875、0.938和0.235mg/ml;紅霉素的MIC50是3.65fig/ml。2.對肺炎衣原體(CP)ATCCVR1435與CP3、CP26、CP31三株臨床分離株樣品A的MICso分別是5、5、2.5和2.5mg/ml;B的MIC5C分別是5、5、無效和5mg/ml;C的MICso分別是無效、5、5禾卩2.5mg/ml;D的MICso分別是5、5、無效和5mg/ml;E的MICso分別是2.5、2.5、5和2.5mg/ml;F的MIC5。分別是1.875、3.75、0.938和1.875mg/ml;紅霉素的MIC5。是15.6ng/ml。(五)結(jié)論-體外抗衣原體效果試驗表明對沙眼衣原體(CT)和肺炎衣原體(CP)，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿及苦參總堿均有良好的抑制作用。實驗三苦參中提取的生物堿抗須癬毛癬菌、紫色毛癬菌和白色念珠菌的活性研究(一)供試樣品樣品A:苦參堿(20mg/ml)樣品B:氧化苦參堿(20mg/ml)樣品C:槐果堿(20mg/ml)樣品D:氧化槐果堿(20mg/ml)樣品E:槐定堿(20mg/ml)樣品F:苦參總堿(30mg/ml)以上樣品用25mMNaAc:HAc緩沖液或氫氧化鈉調(diào)整pH至6左右，與培養(yǎng)基pH保持一致。(二)實驗設計測試菌株須癬毛癬菌標準菌株ATCC18748與三株臨床分離株。紫色毛癬菌標準菌株ATCC11902與三株臨床分離株。白色念珠菌標準菌株ATCCMYA-2310與三株臨床分離株。測試方法微量液體稀釋法(菌濃lxl()S個菌/ml)。樣品終濃度與對照(紅霉素作為已知有效藥物對照)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>陽性對照每排第7孔為培養(yǎng)基加測試菌株。陰性對照每排第8孔為培養(yǎng)基加Buffer。(三)實驗步驟①從第1孔至7孔，每孔加培養(yǎng)基。②每排第8孔，培養(yǎng)基和Buffer各加lOOpl作為陰性對照。③每排第i孔加送檢樣品100^1，然后倍比稀釋到第6孔棄去100^1。@每排第1孔至7孔，各加10(^1菌液。(四)測試結(jié)果1.對須癬毛癬菌標準菌株ATCC18748與三株臨床分離株樣品A的MICso分別是2.5、2.5、1.25和2.5mg/ml;B的MICsq分別是5、5、2.5和2.5mg/ml;C的MICso分別是2.5、5、5和5mg/mhD的MIC50分別是無效、2.5、5禾B5mg/ml;E的MICso分別是5、1.25、5和2.5mg/ml;F的MICso分別是0.938、1.875、1.875和0.938mg/ml;紅霉素的MIC5o是3.65pg/ml。2.對紫色毛癬菌標準菌株ATCC11902與三株臨床分離株樣品A的MICso分別是5、5、無效和2.5mg/ml;B的MICso分別是5、5、無效和5mg/ml;C的MIC5o分別是無效、5、5和5mg/ml;D的MICso分別是5、5、2.5和5mg/ml;E的MICso分別是2.5、1.25、5和2.5mg/ml;F的MICso分別是1.875、3.75、1.875和3.75mg/ml;紅霉素的MIC50是3.65ng/ml。3.對白色念珠菌標準菌株ATCCMYA-2310與三株臨床分離株樣品A的MIC5Q分別是1.25、5、2.5禾Q2.5mg/ml;B的MIC50分別是2.5、5、無效和5mg/ml;C的MIC50分別是5、5、5禾卩5mg/ml;D的MICso分別是5、2.5、1.25禾Q5mg/ml;E的MIC50分別是2.5、5、5和2.5mg/ml;F的MICso分別是1.875、1.875、0.938和1.875mg/ml;紅霉素的MICso是3.65ng/ml。(五)結(jié)論體外抗真菌效果試驗表明對須癬毛癬菌、紫色毛癬菌和白色念珠菌，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿及苦參總堿均有良好的抑制作用。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1苦參總堿的制備方法將符合中國藥典規(guī)定的苦參10kg去泥、沙及其他雜質(zhì)后粉碎待用。用濃度為0.2%的鹽酸100L對所述粉碎苦參進行滲漉，收集滲漉液。用氨水將所得滲漉液的PH值調(diào)至7，此時有沉淀物析出。濾除此沉淀物，收集濾液。所得的濾液通過體積為10L的110型陽離子交換樹脂，然后用5%的氨水50L將樹脂上的吸附物洗脫，收集洗脫液?；厥瞻?，將洗脫液濃縮至干，得苦參總堿152g。實施例2苦參總堿的含量測定1.滴定法取苦參總堿樣品約0.15g，精密稱定，加0.2moI/L鹽酸溶液5ml使溶解，濾過，濾液置入分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，加氯化鈉6g與lmol/L氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，用氯仿振搖提取5次(25、20、10、10、10ml)，每次氯仿提取液均用同一氯化鈉飽和溶液5ml振搖洗滌，再依次分別通過同一裝有無水硫酸鈉lg的脫脂棉層濾過。合并氯仿液，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)10ml及新沸過的冷水20ml，振搖提取后，分取酸層，氯仿層再用新沸過的冷水洗滌3次，每次10ml，合并酸液與洗滌液，置水浴上加熱，除去殘留的氯仿，放冷至室溫，加甲基紅指示液2滴，用氫氧化鈉滴定液(O.lmol/L)滴定。每lml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當于26.44mg的C15H24N202。測得苦參總堿含量以氧化苦參堿計為85.7wt%。2.高效液相色譜法色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以氨基鍵合硅膠為填充劑；乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液(81:10:9)為流動相；檢測波長為220nm。理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計應不低于2000。對照品溶液的制備精密稱取苦參堿對照品、氧化苦參堿對照品適量，分別加乙腈-無水乙醇(80:20)溶解，制成每lml含苦參堿0.0266mg,氧化苦參堿0.2628mg的溶液，即得。供試品溶液的制備取苦參總堿樣品約O.Olg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入氯仿25ml，稱定重量，超聲處理30min,放冷，再稱定重量，用氯仿補足減失的重量，搖勻；精密量取5ml置IOml燒杯中，于水浴上揮至約2ml，放冷后，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各iow，注入液相色譜儀，測定，得苦參堿和氧化苦參堿的含量之和為58.4wt%。實施例3苦參總堿凝膠的制備將卡波姆94010g加入550ml純化水中，自然溶脹24小時，攪勻，放置備用。取苦參總堿40g加入乙醇200ml、丙二醇150g使溶解，將苦參總堿溶液加入備用溶液中，充分攪拌，使成凝膠狀。最后補加純化水至1000g，攪拌均勻、脫氣、灌封、即得。實施例4苦參堿栓劑的制備取苦參堿25g，半合成脂肪酸125g，置8(TC水浴加熱熔化，攪拌均勻，待溫度降至約5(TC時注模，充分冷凝后，刮平取出，制成100粒。實施例5槐果堿軟膏的制備取羊毛脂50g和凡士林946.5g加熱熔化，攪拌，冷卻至約60。C時，加入槐果堿3g，對羥基苯甲酸乙酯0.5g，不斷攪拌至勻，冷凝，分裝，即得。實施例6氧化槐果堿洗液的制備取氧化槐果堿5g，溶于適量蒸餾水中，加吐溫-8020ml，加蒸餾水至10000ml，攪勻，分裝成IOO瓶，滅菌，即得。實施例7氧化苦參堿膠囊的制備取氧化苦參堿50g，加過篩后的淀粉180g、硬脂酸鎂20g混勻，噴乙醇適量，攪拌均勻，制成顆粒，干燥，裝入膠囊，制成1000粒，即得。實施例8槐定堿片劑的制備取槐定堿50g，與過篩后的淀粉100g、微晶纖維素90g、硬脂酸鎂10g混勻，噴乙醇適量，混勻，制粒，壓成1000片，即得。實施例9苦參總堿注射劑的制備取苦參總堿500g，加注射用水9500ml，1,2-丙二醇100ml，氯化鈉90g，用(UN的鹽酸調(diào)pH值至6.0，加注射用水至10000ml，用0.2pm微孔濾膜過濾，灌封，裝成1000瓶，濕熱滅菌，即得。權(quán)利要求1、參中提取的生物堿作為活性成分在治療支原體引起的疾病中的藥物用途。2、苦參中提取的生物堿作為活性成分在治療衣原體引起的疾病中的藥物用途。3、苦參中提取的生物堿作為活性成分在治療真菌引起的疾病中的藥物用途。4、如權(quán)利要求1或2或3所述的苦參中提取的生物堿，其特征在于，是指苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿或苦參總堿。5、如權(quán)利要求4所述的苦參總堿，其特征在于，其中總生物堿含量為70.0wt%99.0wt%，苦參堿和氧化苦參堿的總量為45.0wt%90.0wt%。全文摘要本發(fā)明公開了苦參中提取的生物堿在治療支原體、衣原體和真菌引起的疾病中的藥物用途。所述的苦參中提取的生物堿是指苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿或苦參總堿，其中的苦參總堿中總生物堿含量為70.0wt％～99.0wt％，苦參堿和氧化苦參堿的含量為45.0wt％～90.0wt％?？鄥⒅刑崛〉纳飰A作為活性成分制備的藥物對支原體、衣原體和真菌均有良好的抑制作用，可用于治療由支原體、衣原體和真菌感染引起的各類疾病。
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