2017年國(guó)自然申請(qǐng)標(biāo)書遞交的日子步步逼近，想必大家都在努力完善自己的標(biāo)書吧。近年來(lái)，隨著國(guó)自然基金在職業(yè)晉升中參考比重越來(lái)越大，申請(qǐng)熱度也越來(lái)越來(lái)高，選擇性資助也越來(lái)越看重個(gè)人的工作背景，其中擁有一篇的五分文章成了國(guó)自然面上的默認(rèn)標(biāo)配。
今天就通過(guò)一篇5分的circRNA文章，簡(jiǎn)單介紹這類文章的研究思路，并引出一篇青年項(xiàng)目研究?jī)?nèi)容的設(shè)計(jì)。
Circular RNA ZNF609 functions as a competitive endogenous RNA to regulate AKT3 expression by sponging miR-150-5p in Hirschsprung’s disease.（Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 1), pp: 808-818）
這是Oncotarget于2016年11月份接收的一篇文章。今天我們不討論Oncotarget的Reputation，所以對(duì)于擁有多篇Cancer Research這種level及以上文章的專家完全可以不用care夢(mèng)熊的胡謅。
該文的通訊作者是南京醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院唐維兵主任醫(yī)師。唐主任主要做新生兒的消化道畸形診治。該研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一條在先天性巨腸癥中的circRNA-ZNF609，在正常的腸道組織中該環(huán)狀RNA的表達(dá)量要高于患病組織中的豐度。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)ZNF609能抑制增殖與遷移。接著通過(guò)預(yù)測(cè)的發(fā)現(xiàn)了一些可能與ZNF609結(jié)合的miRNAs，其中有一些miRNAs的靶基因是AKT3，最后，通過(guò)RIP、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)ZNF609能Sponge miR-150-5p，調(diào)控AKT3的表達(dá)。
關(guān)于環(huán)狀RNA，我們之前也簡(jiǎn)單聊過(guò)：（文章篇）S5E49：看看國(guó)內(nèi)團(tuán)隊(duì)是怎么研究環(huán)狀RNA的？（文章篇）一石雙鳥：一個(gè)環(huán)狀RNA circ-Foxo3，兩篇paper（上） 一石雙鳥：一個(gè)環(huán)狀RNA circ-Foxo3，兩篇paper（下）（點(diǎn)擊查看）
接下來(lái)，就通過(guò)這篇文章闡述一下寫國(guó)自然青年基金時(shí)的一些思路：
1、確定分子
circRNA-ZNF609（hsa-circ-0000615）定位于第15號(hào)染色體，全長(zhǎng)874個(gè)堿基。前期已經(jīng)報(bào)道了，在神經(jīng)元細(xì)胞中，circRNA-ZNF609（hsa-circ-0000615）是高表達(dá)的，在中樞神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起到很重要的作用。在該報(bào)道中，作者認(rèn)為該分子應(yīng)該在腸道神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起到重要的作用。
2、確定表型
circRNA-ZNF609是一條新的環(huán)狀RNA。那么作者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在80例先天性巨腸癥組織中的表達(dá)要低于正常腸道組織中的表達(dá)量。這就或許表明circRNA-ZNF609參與了先天性巨腸癥的致病過(guò)程。
既然circRNA-ZNF609可能參與了致病過(guò)程，那么通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，circRNA-ZNF609到底能引發(fā)細(xì)胞的哪些表型變化。
干擾掉circRNA-ZNF609能抑制細(xì)胞的增殖與遷移，過(guò)表達(dá)后則能促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移。
3、確定功能
先確定該分子的定位，實(shí)驗(yàn)證實(shí)circRNA-ZNF609主要定位于胞漿，這表明該分子主要參與了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
前期已經(jīng)報(bào)道，大多數(shù)環(huán)狀RNA屬于內(nèi)源性非編碼RNA，其物種之間有較高的保守性，相對(duì)于線性的RNA，circRNA具有很高的穩(wěn)定性。circRNAs報(bào)道有大量的miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，可以像lncRNA那樣作為miRNAs Sponge吸附miRNAs，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。
小張?jiān)?a target='_blank' data_ue_src='http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzAwMzY4MTYxNw==&mid=2655755023&idx=1&sn=76ede236f7e92be1c58329b5e191ca5d&chksm=80884731b7ffce27d0dbe679031de9ff28b4ac449a86be642a74ccd39a12eb789e0d73a6f3f7&scene=21#wechat_redirect'>這么強(qiáng)大的網(wǎng)站，居然還不會(huì)用？（點(diǎn)擊查看），講過(guò)StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)，其中有一個(gè)功能是ceRNA預(yù)測(cè)。通過(guò)預(yù)測(cè)，作者發(fā)現(xiàn)其中有一條miR-150-5p評(píng)分最高（評(píng)分越高，越可能結(jié)合）。并且驗(yàn)證了它們之間通過(guò)這段序列配對(duì)結(jié)合。
預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在先天性巨腸癥組織中miR-150-5p是高表達(dá)的。
4、尋找靶基因
有了ceRNA機(jī)制，理所當(dāng)然的是找靶基因了。依然是預(yù)測(cè)，作者通過(guò)DIANA、miRanda、PicTar、PITA四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，取交集得到了3個(gè)基因：AKT3、FOXO4、ELK1。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在先天性巨腸癥組織中AKT3的mRNA顯著降低，而FOXO4、ELK1的mRNA則無(wú)明顯變化。到這里，我們就可以推測(cè)出circRNA-ZNF609通過(guò)吸附miR-150-5p，從而上調(diào)AKT3的表達(dá)。
作者通過(guò)雙變量相關(guān)分析，表明AKT3與circRNA-ZNF609的表達(dá)呈正相關(guān)，和miR-150-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)Rescue實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默掉circRNA-ZNF609后，能顯著降低細(xì)胞中的AKT3的mRNA及蛋白的水平；另外加入miR-150-5p的拮抗劑后，能回復(fù)AKT3的mRNA、蛋白的水平。
最后，原本我們應(yīng)該做一下AKT3對(duì)細(xì)胞增殖和遷徙的作用，但是這里作者沒有做，只是做了miR-150-5p對(duì)細(xì)胞相關(guān)功能的影響。
最后，重點(diǎn)來(lái)了：我們從別人的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非編碼RNA（環(huán)狀或長(zhǎng)鏈非編碼RNA）A，在其他一些組織里有報(bào)道，那么這個(gè)分子有可能在我們的研究中也可能起到作用。那么我們通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)在我們所研究的疾病組織檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)A的表達(dá)相對(duì)于正常組織中是高或低表達(dá)的；通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾或過(guò)表達(dá)A后，細(xì)胞具有某種表型變化。而數(shù)據(jù)庫(kù)或預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該分子是主要定位于胞漿中的，那么我們推測(cè)A分子可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制參與疾病的發(fā)生發(fā)展。而circRNA、lncRNA均具有sponge miRNAs的功能，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)A能吸附一些特定的miRNAs，選擇一個(gè)打分比較高的miRNA。接著結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)繼續(xù)預(yù)測(cè)一些能夠與該miRNA結(jié)合的mRNA。最后，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在疾病中，該mRNA翻譯的蛋白表達(dá)情況是否跟A分子呈正相關(guān)。那么作為ceRNA調(diào)控方式的整體框架就有了A-miRNA-mRNA-疾病發(fā)生。
That's all. Thank you!
聯(lián)系客服
