撰文丨黃蔚
責編丨迦溆
環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類呈環(huán)形閉合的單鏈非編碼RNA分子，不具有5‘末端帽子和3’末端多聚腺苷酸化（poly A）尾巴結(jié)構(gòu)。
早在1979年，Hsu MT等人通過電子顯微鏡的觀察，首次在真核細胞中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA【1】。但當時的觀點認為此類RNA屬于轉(zhuǎn)錄的“噪聲”，因而沒有得到重視。
隨著生物信息學的發(fā)展，大量長鏈非編碼RNA（長度大于200nt）被鑒定，引起了廣泛的關(guān)注。然而，主流的轉(zhuǎn)錄組分析大多基于poly A富集的RNA，因此，環(huán)狀RNA雖然與長鏈非編碼RNA一樣廣泛存在，但卻未被發(fā)掘。
直到2013年，Sebastian Memczak等人利用去除rRNA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析【2】，鑒定了大量環(huán)狀RNA，并發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA可通過吸附miRNA發(fā)揮功能的作用方式。之后的5年間，環(huán)狀RNA幾乎成為非編碼RNA研究領(lǐng)域最熱門的選手之一，環(huán)狀RNA被廣泛地鑒定在多種體系中存在，與癌癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也越來越明確。
然而，關(guān)于轉(zhuǎn)錄組中究竟有多少環(huán)狀RNA，這個最基本的問題，一直沒有得到很好的回答?；谛酒沫h(huán)狀RNA表達譜分析，只能了解已鑒定的環(huán)狀RNA。轉(zhuǎn)錄組分析可以鑒定新的環(huán)狀RNA，但目前主要是去除rRNA (RiboZero) 以及RNase R處理（RNase R屬于核酸外切酶，可消化線性RNA）后的轉(zhuǎn)錄組分析方法，前者需要大于5ug的RNA量，后者由于缺乏線性RNA，無法比較環(huán)狀RNA和產(chǎn)生它的線性RNA的豐度。
同時，關(guān)于環(huán)狀RNA在癌癥中的作用方式，大量研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA通過競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）的作用方式，即吸附miRNA，使miRNA無法靶向原目標基因的3‘UTR，發(fā)揮功能。由于環(huán)狀RNA對miRNA的吸附僅需要7-9nt的堿基互補配對即可，ceRNA理論似乎成為了處理環(huán)狀RNA作用機制的“捷徑”。環(huán)狀RNA結(jié)合miRNA后，是否真的解除了miRNA對原靶基因的抑制呢？目前這一理論已受到挑戰(zhàn)。
2月7日，Cell同時在線了兩篇環(huán)狀RNA的研究，試圖為我們解開以上2個疑問，或者說，他們至少讓我們離“真相”更近。
1、關(guān)于轉(zhuǎn)錄組中環(huán)狀RNA的數(shù)量。來自美國密歇根大學的Arul M. Chinnaiyan教授等發(fā)表研究The Landscape of Circular RNA in Cancer，首次利用外顯子捕獲技術(shù)在超過2000例癌癥臨床樣品中，得到了最全的環(huán)狀RNA表達譜，并鑒定了一類由兩個基因的外顯子組成的新型環(huán)狀RNA——Read-through circRNA (圖1)。
圖1
由于目前的研究發(fā)現(xiàn)大部分環(huán)狀RNA都來源于基因的外顯子【2】，研究者利用探針捕獲已知的外顯子序列，再進行深度測序。通過這樣的方式，研究者在超過10種癌癥的2000例臨床樣品中，鑒定到了超過3000個環(huán)狀RNA。與傳統(tǒng)的RiboZero處理得到的環(huán)狀RNA相比，外顯子捕獲測序（Capture）得到的環(huán)狀RNA更多，同時，也包含了大部分RiboZero中的環(huán)狀RNA，說明Capture方法可以更有效的鑒定環(huán)狀RNA（圖2）。同時，由于該方法保留了線性RNA，研究者還發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的表達量與母基因（parent gene）產(chǎn)生的mRNA數(shù)量沒有明顯的關(guān)系，因此不能簡單地將環(huán)狀RNA表達量的變化歸結(jié)為母基因表達的mRNA的變化。
圖2
值得注意的是，研究者將以上環(huán)狀RNA的分析結(jié)果整合到了MiOncoCirc數(shù)據(jù)庫中，這是一個面向所有科研工作者的目前最全面的癌癥中環(huán)狀RNA鑒定和表達模式分析網(wǎng)站，不僅包含環(huán)狀RNA的基因座位信息，還有表達量、基因組結(jié)構(gòu)以及臨床樣品的數(shù)據(jù)（圖3）。
圖3
有趣的是，研究者通過成對的癌組織與正常組織分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA在癌癥中的表達量普遍低于正常組織，并鑒定了一批與預后相關(guān)的環(huán)狀RNA。環(huán)狀RNA具有較高的穩(wěn)定性，這提示它們有作為生物標志物的潛力。非入侵式檢測是一種理想的臨床檢測手段，研究者通過在尿液中提取的僅50ng的RNA，采用外顯子捕獲的方式鑒定了1092個環(huán)狀RNA。這說明利用外顯子捕獲技術(shù)對環(huán)狀RNA進行鑒定具有重要的臨床意義。
此外，在大量的數(shù)據(jù)分析中，研究者鑒定了一類由兩個基因的外顯子組成的新型環(huán)狀RNA，命名為：Read-through circRNA(rt-circRNA)。不同于Guarnerio等人2016年也在Cell發(fā)表的f-circRNA——來源于融合基因的融合位點兩側(cè)外顯子的環(huán)狀RNA，rt-circRNA由位于同一條DNA鏈的兩個臨近基因的外顯子組成（事實上，該研究在2000例樣品的分析中都沒有發(fā)現(xiàn)f-circRNA的存在）。并且rt-circRNA占所有環(huán)狀RNA的2.5%，數(shù)量并不少。它們的形成與RNA聚合酶II在基因座位上的通讀（Read-through）相關(guān)（圖4）。
圖4
總的來說，該研究建立了目前最全面的癌癥中環(huán)狀RNA表達譜分析網(wǎng)站，為環(huán)狀RNA的鑒定及它們在癌癥中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。但同時也應(yīng)注意，環(huán)狀RNA也可由內(nèi)含子組成，而該研究采用的外顯子捕獲方法，顯然錯過了這一部分環(huán)狀RNA，因此，基因組中的環(huán)狀RNA究竟有多少，還需要更深入的研究。
2、環(huán)狀RNA結(jié)合miRNA的生理意義。來自多倫多大學的Housheng Hansen He教授等發(fā)表研究Widespread and Functional RNA Circularizationin Localized Prostate Cancer，首次在局限性前列腺癌中系統(tǒng)的鑒定了環(huán)狀RNA的表達和功能（圖5）。
圖5
局限性前列腺癌是一類常見的男性癌癥，可通過明確的局部治療得到完全緩解，而一旦癌細胞向外轉(zhuǎn)移，則發(fā)展為難以治愈的高侵襲性癌癥。因此，了解局限性前列腺癌發(fā)展的生物學過程，是非常必要的。研究者擬從環(huán)狀RNA的角度分析前列腺癌的發(fā)展過程。在 144例前列腺癌臨床樣品的去除rRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，研究者共鑒定了76311個環(huán)狀RNA，并發(fā)現(xiàn)它們的表達模式與癌細胞的侵襲性相關(guān)。更重要的是，利用shRNA文庫的篩選，研究者在1336個高表達的環(huán)狀RNA中，鑒定了171個環(huán)狀RNA與細胞生長相關(guān)，而敲低這些環(huán)狀RNA對應(yīng)的mRNA則不影響細胞增殖。該結(jié)果說明環(huán)狀RNA在前列腺癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且它們的作用機制獨立于母基因轉(zhuǎn)錄的mRNA。
那么，環(huán)狀RNA是如何行使功能的呢？考慮到環(huán)狀RNA可通過結(jié)合miRNA發(fā)揮功能【3】，研究者以能促進前列腺癌細胞增殖的circCSNK1G3為例，分析了可能與它結(jié)合的miRNA。通過miRNA表達譜及AGO2-clip seq數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)circCSNK1G3可能通過結(jié)合miR-181b/d發(fā)揮功能（圖6）。
圖6
有趣的是，敲低circCSNK1G3對miR-181b/d靶基因（CBX7，CDK1和CDC25A）的影響與過表達miR-181b/d相反，并且回復實驗顯示在敲低circCSNK1G3后過表達miR-181b/d反而能促進細胞的增殖，這說明circCSNK1G3與miR-181b/d在前列腺癌中都發(fā)揮癌基因的作用，circCSNK1G3結(jié)合miR-181b/d后并沒有抑制miR-181b/d的活性，反而circCSNK1G3的減少導致miR-181b/d無法抑制靶基因的表達。這與常見的環(huán)狀RNA的ceRNA作用方式不符。
其實，早在2017年，Piwecka等人在Science上發(fā)表過類似現(xiàn)象的研究【4】，他們認為環(huán)狀RNA吸附miRNA后，實際上是穩(wěn)定了miRNA，使得miRNA可以更好的抑制靶基因的表達，而環(huán)狀RNA的缺失會造成miRNA的降解，因此此時靶基因的表達量反而會上升。而circCSNK1G3的研究正好與它不謀而合。
總的來說，上述研究首次系統(tǒng)的鑒定了前列腺癌中環(huán)狀RNA的表達，并發(fā)現(xiàn)了促進癌癥發(fā)展的環(huán)狀RNA。但是，顯然地，他們的研究忽略了我們上文提到的rt-circRNA，因此，想要全面的了解前列腺癌中環(huán)狀RNA的表達譜，還需進一步分析。同時，我們還應(yīng)注意到，環(huán)狀RNA結(jié)合miRNA后，對miRNA命運的決定具有多樣性，既可能抑制miRNA的活性，也可能促進miRNA的穩(wěn)定，而這兩種完全不同的作用方式是如何被調(diào)控的，目前還不得而知。該問題的解決將有利于我們更全面的了解環(huán)狀RNA的作用機制。
參考文獻
1. Hsu MT, Coca-Prados M. Electron microscopic evidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryotic cells. Nature. 1979 Jul 26;280(5720):339-40.
2. Memczak, S., Jens, M., Elefsinioti, A., Torti, F., Krueger, J., Rybak, A., Maier,L., Mackowiak, S.D., Gregersen, L.H., Munschauer, M., et al. (2013). CircularRNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 495,333–338.
3. Hansen, T.B., Jensen, T.I., Clausen, B.H., Bramsen, J.B., Finsen, B., Damgaard, C.K., and Kjems, J. (2013). Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature 495, 384–388.
4. Piwecka, M., Glazar, P., Hernandez-Miranda, L.R., Memczak, S., Wolf, S.A.,Rybak-Wolf, A., Filipchyk, A., Klironomos, F., Jara, C.A.C., Fenske, P., et al.(2017). Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulationand affects brain function. Science 357, eaam8526
制稿人：子陽
