原創(chuàng)作者：吉賽生物|www.geneseed.com.cn
RNase R ( Ribonuclease R ) 是一種來源于大腸桿菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可從3’-5’方向?qū)NA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R能夠消化幾乎所有的線性RNA分子，但不易消化環(huán)形RNA，因此常用于circRNA的富集和鑒定實(shí)驗(yàn)。湖人今天將介紹RNaseR在circRNA研究中的具體應(yīng)用和常見問題。
1 RNase R的應(yīng)用
1.1.circRNA高通量測(cè)序
高通量測(cè)序是大批量發(fā)現(xiàn)circRNA最快捷的方法，目前對(duì)于circRNA的高通量測(cè)序主要有兩種策略[1]。第一種將total RNA去除rRNA（核糖體RNA）后直接進(jìn)行建庫測(cè)序，不做RNase R消化（RNase R-），也叫全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。第二種將total RNA去除rRNA后進(jìn)行RNase R消化（RNase R+），以使circRNA相對(duì)富集，再進(jìn)行建庫測(cè)序，這種策略結(jié)果中circRNA的junction reads相對(duì)于RNase R-樣本有5-10倍的富集，一般能發(fā)現(xiàn)幾千到上萬個(gè)circRNAs，差異表達(dá)的有幾百到幾千個(gè)。
圖1 RNase R+和RNase R- RNA測(cè)序示意圖（Jeck WR, Sharpless NE, 2014）
1.2 Northern blot
Northern blot是一項(xiàng)特異性檢測(cè)RNA的雜交技術(shù)，使用探針可對(duì)內(nèi)源性的circRNA和/或mRNA同時(shí)/分別做定量和定性檢測(cè)。
對(duì)于線性mRNA的探針，按照一般設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)即可。而呈環(huán)形的circRNA需要針對(duì)其Splice Junction位置設(shè)計(jì)探針。
若同時(shí)使用mRNA探針和circRNA的Splice Junction探針進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果中RNase R-組中應(yīng)該可以同時(shí)檢測(cè)到mRNA和circRNA的條帶。而在RNase R+組中只能檢測(cè)到circRNA條帶，檢測(cè)不到mRNA的條帶（或條帶變淡）[2]。
圖2 Northern blot同時(shí)使用circRNA和mRNA探針（Rybak-Wolf, A. et al., 2015）
注：實(shí)驗(yàn)中也可對(duì)mRNA和circRNA的同源序列設(shè)計(jì)探針，用來同時(shí)檢測(cè)mRNA和circRNA。
1.3 PCR檢測(cè)
Total RNA經(jīng)RNase R消化后可于70℃ 10 min使酶滅活后直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，確保在RNase R-和RNase R+組中使用等量的total RNA，統(tǒng)一以RNase R-組的內(nèi)參（ACTB或GAPDH）作為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。
圖3 RNase R消化后以qPCR檢測(cè)β-actin和FGFR2
圖4 RNase R消化后以qPCR檢測(cè)hsa_circ_0006404和has_circ_0007874
文章里常見的一個(gè)結(jié)果如圖5，分別以Divergent Primer和Convergent Primer檢測(cè)cDNA和gDNA樣品。圖中g(shù)DNA中Divergent Primer無條帶，Convergent Primer有條帶；RNase R+組中Divergent Primer有條帶，Convergent Primer無條帶；RNase R-組中Divergent Primer和Convergent Primer都有條帶，表明檢測(cè)的基因呈環(huán)形，且耐受RNase R消化[3]。
圖5 RNase R消化后分別以Divergent Primer和Convergent Primer檢測(cè)cDNA和gDNA樣品（Yibing Y et al., 2018）
2 RNase R消化實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 反應(yīng)體系
推薦按表1配置反應(yīng)體系。
注：3-4 U/μg RNA為參考文章適用于人或小鼠total RNA的比例，其他物種或條件可能需要適當(dāng)調(diào)整。
2.2 反應(yīng)條件
37℃10-30 min。
注：1）可隨RNA增加適當(dāng)延長消化時(shí)間，一般10-30 min即可消化掉大部分的線性RNA，PCR檢測(cè)線性RNA豐度有幾百倍的降低。消化1 h以上是非必要的，因?yàn)闀r(shí)間過長可能導(dǎo)致少數(shù)耐受力弱的circRNA被消化。2）孵育后可先純化回收，或者70℃ 10 min使酶滅活后直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
2.3 純化回收
消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1, V: V）溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA純化柱和磁珠進(jìn)行純化回收。
注：苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1, V: V）溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，沒有試劑也可以Trizol Reagent代替。
3 常見問題
3.1 內(nèi)參的選擇
應(yīng)用于RNase R消化前后或處理與不處理組的對(duì)比，PCR檢測(cè)的常用內(nèi)參ACTB或GAPDH都因被消化而不能使用。此時(shí)可將原始的RNA樣品等分為兩份，一份經(jīng)RNase R消化（RNase R+），另一份不處理（RNase R-），以RNase R-組的內(nèi)參作為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。
3.2 定量計(jì)算
將原始RNA樣品等分為兩份，一份經(jīng)RNase R消化，另一份不處理，此時(shí)認(rèn)為兩組中RNA等量，內(nèi)參一致，以不處理組的內(nèi)參（ACTB或GAPDH）作為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。
考慮RNase R消化后如果進(jìn)行純化回收，則RNase R+組中RNA濃度/總量可能有變化，不適宜再以RNase R-組的內(nèi)參（ACTB或GAPDH）作為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)。此時(shí)可在純化回收前加入少量其他物種的RNA作為外參，統(tǒng)一以外參標(biāo)準(zhǔn)化樣品后進(jìn)行計(jì)算[4]。
Total RNA經(jīng)RNase R消化后直接進(jìn)行RT-PCR的，一般可以不做純化回收，保持70℃ 10 min使酶滅活后直接進(jìn)行RT即可。
3.3 Total RNA消化后應(yīng)該是怎樣的？
對(duì)于真核生物的total RNA，RNase R-組中28S/18S/5S三條帶單一明亮（5S較淡），而RNase R+組中28S/18S/5S條帶變淡或不可見。但如果RNase R+組中5S條帶加亮，且28S/18S條帶處有拖尾，則可能是RNA被外源RNA酶降解，而不是RNase R消化產(chǎn)生的。
如圖6中使用10 U RNase R消化2.5 μg total RNA，保持37℃ 30 min，之后直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示RNase R+組28/18/5S條帶變淡（不可見），表明RNase R對(duì)total RNA的消化作用。
圖6 Total RNA 經(jīng)RNase R消化后直接進(jìn)行電泳檢測(cè)
3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致性（重復(fù)性）差
常見的RNase R消化RNA后進(jìn)行qPCR檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)，容易碰到的問題是多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差別很大，可能的原因和解決方法如下。
1）加樣不準(zhǔn)，RNA或RNase R的用量有誤差，導(dǎo)致內(nèi)參不齊或者消化程度不一致。在同一對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，除了是否加RNase R外，應(yīng)確保其他所有反應(yīng)條件一致。
2）兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。盡量同時(shí)進(jìn)行RNase R+和RNase R-組的消化實(shí)驗(yàn)，使用相同的反應(yīng)條件，PCR檢測(cè)使用同樣的條件和引物等。
3）檢測(cè)mRNA和circRNA豐度都沒有明顯變化?？赡苡捎赗Nase R消化反應(yīng)體系、程序不對(duì)，或者RNA使用量過多。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)使用配套的10X Reaction Buffer配置反應(yīng)液，使用推薦的反應(yīng)溫度和時(shí)間，另外添加MgCl2（Mg2+濃度最高0.5 mM）可以增強(qiáng)RNase R的活性。
4）RNase R+組檢測(cè)不到circRNA?？赡苡捎赾ircRNA豐度過低未能檢測(cè)到，或者RNA樣品被外源RNA酶降解。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)使用RNase-Free（DEPC處理）的槍頭、離心管和水等耗材試劑。
5）RNase R+組中circRNA豐度有明顯降低。除了考慮RNA樣品被外源RNA酶降解外，也有發(fā)現(xiàn)少數(shù)circRNA耐受RNase R消化力弱的，提示檢測(cè)的circRNA可能也被消化。
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參考文獻(xiàn)：1. Jeck WR, Sharpless NE. Detecting and characterizing circular RNAs. Nat Biotechnol. 2014; 32:453–61.
2. Rybak-Wolf, A. et al.. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Mol. Cell. 58, 870–885 (2015).
3. Yibing Yang et al.. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis. J Natl Cancer Inst. 2018 Mar 1;110(3).
4. Pamudurti, Nagarjuna Reddy et al.. Translation ofCircRNAs. Molecular Cell , Volume 66 , Issue 1 , 9 - 21.e7.
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