又是周四啦，我們又見面啦?，F(xiàn)在地標(biāo)北京，我今天到北京來參加兒博會(huì)的交流學(xué)習(xí)。這是第一次覺得北京比重慶熱，北京溫度34℃，而重慶是27°。感覺還挺奇特的。今年重慶的天氣簡直好到爆，看了最近天氣預(yù)報(bào)，一直到月底才會(huì)升溫。在這里先感謝我的小仙女師妹，因?yàn)樽蛱焱砩想x開實(shí)驗(yàn)室比較急，很多素材還沒有拍照。所以遠(yuǎn)程遙控了她幫我拍的照片。這有一半她的功勞。
在過去的一周比較特別，因?yàn)槲易隽擞嘘P(guān)qRTPCR的實(shí)驗(yàn)。為什么特別呢？第一，我的標(biāo)本是一批子宮內(nèi)膜原代上皮細(xì)胞；第二，這批細(xì)胞存放在RNA裂解液，并放置于-20℃冰箱中14個(gè)月（圖1）；第三，因?yàn)榧?xì)胞珍貴且存放時(shí)間長，所以提取出的RNA含量平均只有10-40ng/uL；第四，因?yàn)榧磳厴I(yè)，所以把實(shí)驗(yàn)安排的比較急，一天做了10個(gè)96孔（圖2）。
這次的整個(gè)實(shí)驗(yàn)開始都是在一個(gè)十分不利的環(huán)境中，我和很多人一樣都想過要放棄。但是，但是因?yàn)檫@個(gè)細(xì)胞十分珍貴，非常難培養(yǎng)，且來之不易（這是我的導(dǎo)師從美國給我?guī)淼模?。另外之前我也做過幾十ng/uL的RNA標(biāo)本，所以斗膽一試。
那面對這樣濃度的RNA標(biāo)本，我首先要把RNA濃度給提升上去，那怎么提升呢，今天給大家分享我常用的兩個(gè)DNA/RNA濃縮方法。
所謂濃縮，就是在總含量一定的基礎(chǔ)上，減少液體體積量，這樣濃度就會(huì)提升上去了。就是基于這么簡單的一個(gè)道理，Thermo fisher生產(chǎn)了一臺(tái)可以濃縮DNA/RNA的儀器，如下圖3。
一般RNA標(biāo)本在選擇中檔，中溫，一個(gè)小時(shí)內(nèi)，RNA的濃度可以提升2-5倍，并且不會(huì)降解。如果時(shí)間過長、溫度過高都會(huì)造成RNA的降解；對于DNA標(biāo)本的話，可以自行選擇。
在使用機(jī)器前最好把機(jī)器從內(nèi)到外用75%酒精消毒，小心操作，盡量避免所有可以接觸到DNA酶或RNA酶的操作。在這里，肯定有很多人會(huì)質(zhì)疑說高溫會(huì)不會(huì)使RNA/DNA降解，尤其是RNA。不知道大家在使用Takara進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)的時(shí)候，第一步有個(gè)85℃的步驟，不知道有沒有注意到呢。
因?yàn)檫@個(gè)機(jī)器主要裝1.5或2mL的EP管，所以在操作時(shí)需要把蓋子打開，所以如果有可能請將此儀器放入一個(gè)相對比較干凈的環(huán)境。
其他的操作按著說明書來就可以。
另外一種濃縮方法是許多測序公司用來濃縮的辦法，我也不曉得具體叫什么名字，所以直接介紹步驟。
配置3M pH=5.2的醋酸鈉，0.22um濾器過濾保存，切記，此溶液若想長期保存，請置于玻璃容器中（一般人我不告訴他）不然容易析出，短期使用的話是可以放在塑料容器中的。
配置75%的乙醇，此處用于配置的無水乙醇需要用到分析純，至于-20°中保存。
準(zhǔn)備一定量的無水乙醇至于-20°中保存。
準(zhǔn)備異丙醇。
在RNA/DNA標(biāo)本中加入1/10體積的醋酸鈉，混勻。
加入1中2倍體積的100%、-20°保存的無水乙醇，混勻，置于-80°中至少放置20min或-20°中至少放置2h。
加入2/3體積的異丙醇，室溫放置1min。
離心，大于11000g，4°，30min。
棄上清，加入75%冰乙醇混勻。
重復(fù)步驟4。
控干，加入需要體積的DEPC水。
因?yàn)槲抑坝卸啻斡肨hermofisher DNA L200濃縮RNA的經(jīng)驗(yàn)，并且我只是希望RNA的濃度提升到60-70之間。所以我這一次實(shí)驗(yàn)就是用真空濃縮了RNA，中檔、半小時(shí)，最后測定的濃度大概升高了2-5倍。
我們都知道一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄體系一般逆轉(zhuǎn)1ugRNA，20uL體系。而你得到的cDNA在做qRT-PCR時(shí)會(huì)稀釋10倍再用，每一個(gè)qRT-PCR反應(yīng)用到2uL。意思就是你的RNA量有個(gè)5ng/uL就可以做出后面的qRT-PCR?？吹竭@里，是不是很興奮。我通過這樣一算，瞬間覺得我肯定做的出來。
我把RNA統(tǒng)一到30ng/uL。
Takara的體系最多可以加到7uL的量，意思就是我的每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系用到的總RNA量是210ng。
因?yàn)闃?biāo)本珍貴，所以也就沒有在乎逆轉(zhuǎn)錄酶了，我的RNA總體積是30-40uL，所以我每個(gè)標(biāo)本逆轉(zhuǎn)了4-5個(gè)，所以總共是80-100uLcDNA。
根據(jù)以上我們可以知道我的這個(gè)cDNA還可以對半稀釋。
我最后用了上述的cDNA跑了10個(gè)板子的熒光定量PCR。給大家看看其中一組的擴(kuò)增曲線。
最后結(jié)果還挺好的。之所以分享這次經(jīng)歷，并不是讓大家鋌而走險(xiǎn)喲，只是告訴大家在標(biāo)本很珍貴的情況下，多一種可能性，多一種選擇。希望大家實(shí)驗(yàn)順利。最后來張北京的天，證明我來了，哈哈哈哈哈哈。好無聊。
