摘要：苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性。
qRT-PCR，是Quantitative Real-time PCR 的簡(jiǎn)稱，也叫實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物的總量，通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
qRT-PCR目前已成為不同樣本間進(jìn)行基因表達(dá)水平差異比較權(quán)威的方法。然而不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，沒(méi)有足夠的對(duì)照和重復(fù)，低質(zhì)量的RNA樣本，逆轉(zhuǎn)錄引物選擇不理想，qRT-PCR的引物退火溫度選擇不當(dāng)和數(shù)據(jù)分析方法不正確等都可能會(huì)成為影響qRT-PCR檢測(cè)靈敏度的因素。
下面普健生物就從8個(gè)方面帶你詳細(xì)了解一下qRT-PCR的注意事項(xiàng)，以提高你的實(shí)驗(yàn)成功率。
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
由于RNA易降解,對(duì)外在環(huán)境敏感，因此在實(shí)驗(yàn)條件或樣本操作等各個(gè)環(huán)節(jié)都需要嚴(yán)格把控。
2、RNA抽提
RNA的抽提環(huán)境非常關(guān)鍵。由于RNA酶無(wú)處不在和其難以滅活的頑固本性，在實(shí)驗(yàn)的每一步，任何偶然的疏忽或不妥當(dāng)?shù)牟僮鞫加锌赡茉斐蒖NA酶的污染，從而導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗。因此，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，避免任何可能的污染，是保證實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。
RNA抽提建議用專用的操作區(qū)，離心機(jī)、移液槍、試劑等均應(yīng)專用；所用的耗材、溶液及試劑均應(yīng)是RNase-free或經(jīng)過(guò)DEPC處理過(guò)的（這一步很費(fèi)精力但不得不做，所以失敗了會(huì)很痛苦）；操作過(guò)程中應(yīng)始終戴一次性橡膠手套，并經(jīng)常更換，以防手臂上的細(xì)菌、真菌以及人體自身分泌的RNA酶造成污染；避免在操作中說(shuō)話聊天并且要記得戴口罩以防RNA酶污染； 提取過(guò)程應(yīng)盡量保持低溫環(huán)境（所以戴個(gè)手套是正確的選擇）并減少操作時(shí)間。
關(guān)于什么是Trizol，某百科是這樣說(shuō)的：
Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。為縮短RNA抽提的操作時(shí)間，建議以10-20個(gè)樣本的小批次來(lái)處理樣本。無(wú)論是Trizol 手提RNA還是使用試劑盒抽提RNA都應(yīng)包括DNaseI處理步驟以便去除基因組DNA污染。如果樣本在采集后不能立即處理，則需要把樣本保存于-80℃（樣本直接凍存或保存于Trizol中）。
3、RNA 質(zhì)量控制
在qRT-PCR中使用高純度（無(wú)污染）和高完整性（無(wú)降解）的RNA是最基本的要求。不純的RNA樣品會(huì)抑制PCR反應(yīng)，產(chǎn)生偏離的數(shù)據(jù)。使用部分降解的RNA會(huì)產(chǎn)生可變和不正確的定量結(jié)果。因此RNA樣品的純度和完整性是進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)的最基本要求。
如何檢測(cè)？
RNA樣品是否有蛋白污染可以通過(guò)OD260/280分光光度法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。比值在1.8-2.2之間則表示該RNA質(zhì)量好，沒(méi)有蛋白和苯酚的污染。
RNA的完整性可通過(guò)甲醛變性瓊脂糖電泳（普通的瓊脂糖凝膠電泳也可）來(lái)觀察。
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高完整性的RNA樣品可明顯地觀察到28S和18S兩條帶，并且28S的條帶亮度約是18S的兩倍。若兩條條帶不明顯，則提示RNA可能部分降解。
通過(guò)確保所有RNA樣品的純度和質(zhì)量的一致性可以降低生物學(xué)重復(fù)的差異。
4、逆轉(zhuǎn)錄
鑒于RNase在環(huán)境中廣泛存在，我們建議在檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量后將總RNA樣本立即逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。這種處理避免了RNA樣品因反復(fù)凍融或其他不當(dāng)操作而導(dǎo)致RNA降解。
在逆轉(zhuǎn)錄步驟中，最關(guān)鍵的是抽提的RNA樣品能否完整地覆蓋基因組。使用mRNA末端配對(duì)引物（Oligo dT primer）和mRNA序列隨機(jī)位點(diǎn)配對(duì)引物（Random primer）的組合可以得到每個(gè)基因的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物群。此方法比單一的末端或隨機(jī)位點(diǎn)配對(duì)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可以更好地覆蓋基因組。為了減少不同生物學(xué)重復(fù)之間的差異，每次逆轉(zhuǎn)錄使用的RNA量和反應(yīng)時(shí)間應(yīng)相同。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA可長(zhǎng)期凍存于-20℃或-80℃。
5、引物和擴(kuò)增片段的設(shè)計(jì)
引物的設(shè)計(jì)和目標(biāo)序列的選擇對(duì)有效地?cái)U(kuò)增和產(chǎn)物的特異性至關(guān)重要。目標(biāo)序列應(yīng)是唯一的，長(zhǎng)度建議在75-300 bp之間，GC含量約50%-60%。目前有許多引物設(shè)計(jì)軟件及在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站，操作者應(yīng)在設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)階段保證擴(kuò)增片段的特異性。建議引物的GC含量在50-60%之間，退火溫度在55℃-65℃。
AtaGenix出品的典型擴(kuò)增曲線是這樣的
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6、qRT-PCR的擴(kuò)增與驗(yàn)證
PCR反應(yīng)中引物與目的序列的退火溫度選擇非常關(guān)鍵。在合適的溫度下，引物可有效地與其目標(biāo)序列進(jìn)行退火，并降低了非特異性退火和引物二聚體的形成。在正式進(jìn)行qRT-PCR之前應(yīng)該對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化（可以通過(guò)做梯度PCR來(lái)優(yōu)化）。PCR產(chǎn)物的特異性對(duì)于結(jié)果也至關(guān)重要。通過(guò)PCR反應(yīng)后進(jìn)行的溶解曲線的分析，可對(duì)產(chǎn)物的特異性進(jìn)行檢測(cè)：溶解曲線應(yīng)該顯示出一個(gè)單一尖銳的峰。
AtaGenix出品的典型的溶解曲線是這樣的
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此外，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是否正確。
7、數(shù)據(jù)分析
在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因被用來(lái)作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照，以校正作為模板的cDNA所存在的數(shù)量差異。常用來(lái)作為內(nèi)參的有GAPDH、β-actin或rRNA。操作者應(yīng)根據(jù)不同來(lái)源的樣品選擇不同的參照基因。
進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)分析普遍采用操作簡(jiǎn)便的2-ΔΔCT法，此方法的應(yīng)用基礎(chǔ)是目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增效率都接近100%并且相互間效率偏差在5%以內(nèi)。所有實(shí)驗(yàn)組（Test）和對(duì)照組（Control）均應(yīng)得到內(nèi)參基因的CT值(CTreference)和目的基因的CT值(CTtarget)，用各組的內(nèi)參基因CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
ΔCT（test）=CT（target,test）- CT（reference,test）
ΔCT（control）=CT（target, control）- CT（reference, control）
接下來(lái)，用對(duì)照組的ΔCT值歸一實(shí)驗(yàn)組的ΔCT值：
ΔΔCT=ΔCT（test）-ΔCT（control）
最后，計(jì)算表達(dá)水平比率：
實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)對(duì)照組目的基因的表達(dá)量=2-ΔΔCT
得到的結(jié)果是通過(guò)參照基因表達(dá)水平校準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)組中目的基因相對(duì)于對(duì)照組中目的基因增加或減少的倍數(shù)。
8、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和重現(xiàn)性
在qRT-PCR的檢測(cè)中，有兩個(gè)可變因素可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果：一個(gè)是不同生物個(gè)體，組織或細(xì)胞等樣本間基因表達(dá)水平的內(nèi)在差異所導(dǎo)致的生物學(xué)差異；另一個(gè)是移液操作或移液器本身等原因?qū)е碌膶?shí)驗(yàn)過(guò)程本身存在的技術(shù)差異。為減少生物學(xué)和技術(shù)差異的影響，一般認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中至少要設(shè)置三個(gè)生物學(xué)樣品重復(fù)且每個(gè)生物學(xué)樣品至少應(yīng)有三個(gè)技術(shù)性重復(fù)。
參考文獻(xiàn)：文章參照并引用了部分實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR的國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)MIQE指南及BIO-RAD熒光定量PCR應(yīng)用指南。
