啥是熒光定量PCR
啥是熒光定量PCR
實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR），簡稱Q-PCR，是一種在擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物的總量，通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定基因序列進行定量分析的方法。
Q-PCR有三個特別重要的指標
擴增曲線是PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標，以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映Q-PCR的動態(tài)進程。
溶解曲線是用來驗證擴增產(chǎn)物特異性的，如果產(chǎn)物是單一條帶，溶解曲線就會出現(xiàn)單峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現(xiàn)至少兩個峰。
熒光閾值
一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環(huán)熒光信號標準差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴增的指數(shù)期（分為基線期、指數(shù)期以及平臺期）。
Ct值
PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。
Q-PCR數(shù)據(jù)分析·2-ΔΔCt法
1.內(nèi)參基因Ct值歸一目標基因Ct值：
ΔCt(test)=Ct(target, test)-Ct(ref, test)
2.對照樣品ΔCt值歸一實驗樣品ΔCt值：
ΔΔCt=ΔCt(test)-ΔCt(control)
3.計算相對表達量：
相對表達量=2-ΔΔCt
常見問題解答
一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結(jié)果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴增，但也不是絕對的，需要輔以溶解曲線或電泳結(jié)果加以解釋
一般是由于模板不足或降解，亦或是引物降解
模板的起始濃度過高，可以降低模板濃度
擴增產(chǎn)物過大或模板降解，亦或是PCR反應(yīng)條件不夠優(yōu)化
這樣一般都是由于有DNA的污染。
這里奉上經(jīng)過大量實驗總結(jié)的小竅門
模板制作,小便宜別去占
所謂的目標模板也就是我們常說的陽性對照，你可去購買現(xiàn)成的，當然實驗經(jīng)費不充足一般都要我們自己制備。在這里提醒廣大寶寶們不要為了省那點錢而去買便宜的載體，最好購買師兄師姐或者有類似經(jīng)驗的人推薦的載體。
測定模板濃度時最好選用微量核酸測定儀，每次僅需要1-2ul的樣品，既不會污染你的樣品也不用像紫外分光光度計那樣需要稀釋，簡單、精確、靈敏。實驗中對模板進行稀釋時，盡管每次使用的量很少，推薦一次性吸取10 ul倍比稀釋，因為量越多誤差也就越小。
引物印證這一步，別小覷
當拿到公司合成好的引物時，先通過普通的PCR來初步印證一下，擴增條帶是否單一，條帶大小是否的在預(yù)計的范圍。若不符合這些，直接不用進行熒光定量PCR，重新設(shè)計引物。若符合條件，接下來就進行熒光定量PCR實驗，觀察擴增取曲線，以及熔解曲線是否單一。滿足條件后可開始正式的熒光定量PCR實驗，一般每稀釋一個梯度，CT值差3左右。
程序設(shè)置，聽說明書，還是機器設(shè)定？
實驗開始前，我也看了很多文獻啊各種機器的介紹啊，大部分是要求按照機器自帶的程序或已經(jīng)設(shè)定好的程序進行就可以了。但我比較了我的熒光染料說明書的要求的程序與機器設(shè)定好的程序，相差太大。說明書中說預(yù)變性溫度不要超過30s，會影響染料的活性，可是機器設(shè)定的是預(yù)變性5min，這個時候你一定要按照說明書的來哦。
捷瑞家可以提供的
根據(jù)您要檢測的物種/基因，專業(yè)實驗團隊為您量身定制引物和探針，并進行優(yōu)化調(diào)試 在您開始實驗之前，本公司將為竭誠您提供最有效的熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)方案 接受采用熒光定量PCR的檢測方法針對各種檢測目標的合作研發(fā)和委托研發(fā) mRNA、miRNA、lncRNA及circRNA表達檢測 基因拷貝數(shù)檢測（土壤中細菌、真菌、固氮菌等含量的檢測和功能基因檢測）
服務(wù)流程
樣品核酸提取 PCR引物設(shè)計與合成 ↓ 引物調(diào)試（預(yù)實驗） ↓ PCR擴增檢測 ↓ 數(shù)據(jù)匯總初步分析 標準品合成及標準曲線構(gòu)建（絕對定量）
我們的檢測方法
SYBR GREEN I法 Taqman探針法
1、嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計，每個樣品提供三復(fù)孔重復(fù)數(shù)據(jù)，保證實驗結(jié)果的準確性。
2、熒光定量PCR后，分析溶解曲線，保證產(chǎn)物的特異性。
需要您提供的
基因名稱（提供Genbank登錄號），待測樣本（清晰樣品編號），以及詳細的實驗要求和數(shù)據(jù)分析要求。
樣本寄送
1、可檢測樣本：組織、細胞、cDNA，RNA樣品等
2、捷瑞生物可免費提供RNA保存液
3、樣品收到后會進行樣品評估，評估結(jié)果會及時反饋給客戶確認
4、關(guān)于取樣送樣有任何疑問，可詳詢support@generay.com.cn或021-67840418并索要《捷瑞生物熒光定量PCR送樣指導(dǎo)書》
檢測周期
常規(guī)檢測任務(wù)最快一周即可完成，樣品數(shù)較多或檢測條件需要反復(fù)優(yōu)化的情況下，時間適當加長
報告內(nèi)容
1、 樣品評估結(jié)果（RNA或DNA濃度、電泳圖片等）
2、 引物調(diào)試與樣本擴增結(jié)果（擴增曲線/溶解曲線/標準曲線）
3、 定量PCR原始數(shù)據(jù)結(jié)果
4、 Ct值和RQ值
5、 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（可選）
6、 實驗報告使用說明
床前明月光
年后你別慌
實驗?zāi)阏椅?/span>
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