蛋白提取可以分為三個步驟：第一步獲取材料，第二步分離目的細胞或組織成份并破碎，第三步就是進行裂解制樣。這里就這三個步驟展開一一討論。
材料的獲取
從大方向講，Western Blot的對象可以是植物組織、動物組織和培養(yǎng)物。植物組織的獲取一般應該不是很困難，尤其是可進行人工種植的植物更是方便。動物組織的獲取就相對困難許多，一是要考慮到法律上的問題，二是需要實驗者有豐富的解剖經(jīng)驗，可以快速準確地從動物體上取下需要的組織或Organ(要和諧，下同)。培養(yǎng)物就不用多說了，幾乎每個實驗者都養(yǎng)過細菌或者細胞的。如果是動物組織或者植物組織，一般情況下都可以用手術刀和手術剪從個體上分下需要的部份。如果是細菌，則可以將養(yǎng)好的菌液收集起來離心，然后棄去上清即可，如有必要，可以再用等滲中性溶液洗滌數(shù)次。如果材料是培養(yǎng)的細胞，建議將細胞從培養(yǎng)瓶（皿、板）內(nèi)刮下來再離心處理，也可以不收集采取而直接在培養(yǎng)容器中裂解，詳見下文。非常不建議用酶將細胞從培養(yǎng)器皿上消化下來再進行裂解。在組織或者細胞進行裂解之前，一般都要將組織或者細胞清洗干凈（對于組織可用預冷的等滲buffer洗滌，對于細胞也用等滲buffer洗滌再用離心法去掉洗滌液即可），以除去組織中的污垢、血液和細胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)基以及添加物。
細胞破碎
如果收集到的材料是組織或者Organ，第一步往往是將它們分切成小塊方便操作。接下來就是準備進行細胞破碎了。細胞破碎的方法分為機械法和非機械法，機械法可以是振動、攪拌、研磨、壓濾、超聲、勻漿，非機械法可以是干燥、改變滲透壓、凍融、酶解（纖維素酶、溶菌菌、蝸牛酶）等，不同來源的材料對于不同的處理方法耐受程度是不一樣的，例如超聲波可以很容易破碎動物細胞，但是破碎酵母細胞就困難許多。在這里有三個問題需要指出：
（1）所有的操作盡量在低溫條件下進行，防止細胞內(nèi)的蛋白酶釋放出來而將目的蛋白降解，最好全程都在冰浴中進行，有條件用液氮的就用液氮，下同。
（2）超聲處理中會釋放出大量的熱，因此一定需要冰浴。同時超聲過程會釋放自由基，有可能改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可向系統(tǒng)中加入少量的GSH（谷胱甘肽）進行還原。
另外，超聲過程有可能打斷蛋白質(zhì)大分子，所以如果研究的蛋白質(zhì)分子量比較大時建議減少超聲處理時間或者換用其它方法處理。
（3）如果使用蛋白酶處理，可能會將目的蛋白降解，同時還引入了新的蛋白質(zhì)從而干擾實驗，所以一般不推薦使用。細胞的破碎與裂解過程沒有嚴格的時間和空間界線，其作用僅僅是為了使裂解過程更容易，因此在破碎細胞過程中所用的Buffer一般也是裂解時的裂解液，注意不能加太多，根據(jù)經(jīng)驗，一般每克組織加2-3ml裂解液為宜。
雜質(zhì)的去除 除了前面獲取材料時提到的組織中的污垢、血液和細胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)基以及添加物這些雜質(zhì)外，附在組織上的油脂、細胞外層的細胞壁、細胞內(nèi)部的長鏈DNA等都會干擾Western Blot中的SDS-PAGE一步，因此有必須除去。 對于油脂，一般可以直接離心除去（一般以10000g離心10min油脂都會漂浮在最上層，吸走即可），也可以利用SiO2將其吸附而離心除去（10000g，10min，油脂在下層）。對于細胞壁，一般在裂解液中的溶解比較差，待裂解完直接離心除去即可。對于長鏈DNA，可用鏈霉素使之沉淀再離心除去，也可以用超聲波處理將其打斷變成小片段DNA，就不會干擾SDS-PAGE而不用從體系中除掉。
蛋白質(zhì)的提取 蛋白質(zhì)的提取過程，簡言之就是使細胞內(nèi)的靶蛋白盡可能都溶解于液相而方便進行電泳，其核心思想就是根據(jù)靶蛋白的特性，選擇合適的助溶劑和保護劑。這一部份涉及到的內(nèi)容比較多，我就一步一步地討論。
（1）蛋白質(zhì)的分類
蛋白質(zhì)的分類方法比較多，可以按照功能分類、可以按照在細胞中的定位分類、可以按照溶解性分類、可以按照三維結(jié)構(gòu)分類。 這里只提按溶解性和在細胞中的定位分類法，這兩種分類對理解蛋白質(zhì)的提取極有幫助。 按照溶解特性分類，蛋白質(zhì)的分類情況如下：（參閱王鏡巖版生物化學）
種類 | 舉 例 | 溶解特性 |
| 清蛋白 | 血清白蛋白、卵清蛋白 | 溶于水和中性鹽溶液，不溶于飽和硫酸銨溶液 |
| 球蛋白 | 免疫球蛋白、肌球蛋白 | 不溶于水，溶于稀中性鹽溶液，不溶于半飽和硫酸銨溶液 |
| 谷蛋白 | 米谷蛋白 | 不溶于水、中性鹽及醇，溶于稀酸、稀堿 |
| 醇溶谷蛋白 | 小麥醇溶谷蛋白 | 不溶于水、中性鹽溶液，溶于70-80%乙醇中 |
| 硬蛋白 | 角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白 | 不溶于水、稀中性鹽、稀酸、稀堿和一般有機溶劑 |
| 組蛋白 | 胸腺組蛋白 | 溶于水、稀酸、稀堿、不溶于稀氨水 |
| 精蛋白 | 魚精蛋白 | 溶于水，稀酸，稀堿、稀氨水 |
了解了蛋白質(zhì)的溶解特性，就可以考慮用合適的試劑將蛋白質(zhì)溶解或者將高豐度的蛋白質(zhì)從體系中除去。
按照蛋白質(zhì)在細胞中的定位，籠統(tǒng)上講可以分為三類：膜蛋白、胞漿蛋白（包括內(nèi)膜系統(tǒng)蛋白)和核蛋白。其中膜蛋白的結(jié)構(gòu)相對來說比較復雜，是蛋白質(zhì)提取中挑戰(zhàn)最大的一類；胞漿蛋白則都比較容易提取，它們大多數(shù)可以直接溶于生理鹽溶液中；核蛋白則往往容易形成復合體或與核酸結(jié)合在一起，同時組蛋白還含有大量帶正電的組氨酸而在電泳過程中可能出現(xiàn)電泳速度和預計分子量不符的情況。
（2）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定
自從細胞破裂后，很多蛋白質(zhì)就變得不穩(wěn)定起來，其中一些蛋白質(zhì)會發(fā)生自行降解，另外一些蛋白質(zhì)可能在從細胞內(nèi)釋放出來的蛋白酶的作用下而被水解，還有一些在機械剪切力的作用下發(fā)生斷裂。于是不難理解在進行蛋白質(zhì)提取過程中有這么幾個因素需要注意：輕柔、低溫、加蛋白本酶抑制劑。輕柔操作這個就不多說了，動作小心點就是，低溫操作前面也講到過，全程冰上進行是最好的，下面重點說說蛋白酶抑制劑。首先先來了解一下蛋白酶。蛋白酶依據(jù)其活性中心，可以分為這么幾類：絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶（罕見）。另外對于磷酸化Western blot的實驗，還要考慮磷酸酶。對于上述不同的蛋白酶目前幾乎都有有效的抑制劑，在提蛋白過程中加入這些蛋白酶抑制劑可以極有效地防止靶蛋白被內(nèi)源性的蛋白酶降解。常用的蛋白酶抑制劑有以下幾種：
絲氨酸蛋白酶抑制劑： PMSF，AEBSF-HCl，Aprotinin，Chymostatin，亮肽素（Leupeptin）
天冬氨酸蛋白酶：PMSF，碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝發(fā)酵物
巰基蛋白酶抑制劑：PMSF，TLCK，TPCK，Antipain-HCl,N-乙基順丁烯二酰亞胺
金屬蛋白酶抑制劑（金屬離子螯合劑）：EDTA，EGTA，塔羅肽
蘇氨酸蛋白酶：目前缺乏資料
磷酸酶抑制劑：NaF，激活的原礬酸鈉（激活方法將在試劑檔案提及）、焦磷酸鈉、β-甘油磷酸鈉。
各種蛋白酶抑制劑的使用方法和濃度范圍將在本站試劑檔案欄目中提及，如果您覺得這些試劑購買和配制麻煩，也可以買商品化的雞尾酒系列（cocktail)，它們一般包括了大部份的蛋白酶抑制劑種類，使用起來也極為方便。
（3）蛋白質(zhì)裂解液的選擇
對于水溶性的蛋白質(zhì)提取一般來說都非常簡單，只需要將細胞充分破碎將其釋放出來即可，但是對于一些膜蛋白、包涵體等難溶的蛋白必須采用助溶劑溶解。常用的助溶劑有這么幾種：鹽酸胍、尿素、硫脲、稀酸、稀堿、去垢劑（又叫表面活性劑或去污劑）。需要注意的是用這些方法助溶的蛋白質(zhì)被經(jīng)過快速稀釋的時候依然可能出現(xiàn)沉淀，尤其在跑膠上樣的時候，已經(jīng)溶解的蛋白質(zhì)仍然可能變成不溶解的狀態(tài)，因此使用時建議初步裂解后將初步裂解的樣本離心處理，然后再向不溶成份中加入這些助溶劑，然后再用離心得到的上清緩慢稀釋防止再次沉淀。另外，鹽酸胍溶解的樣品跑膠時很出現(xiàn)沉淀，慎用；用稀酸溶解的樣品不能進行跑膠，因此可能只能作為一種除去非目標蛋白的參考手段。這里重點提一下去垢劑，在所有助溶劑里去垢劑是最有效的，而且較低的濃度就可以起到很明顯的效果。所有的去垢劑都由兩部份組成，一部份是親水的，一部份是疏水的，在助溶蛋白質(zhì)的過程中，去垢劑的疏水基團一般主要和蛋白質(zhì)結(jié)合，親水基的一端則傾向于溶解在水中。溶于水后能解離成離子的去垢劑叫離子型去垢劑，否則叫非離子型去垢劑，離子型去垢劑按照水中生成的離子類型又可以分為陽離子型去垢劑、陰離子去垢劑和兩性離子去垢劑，近年來還發(fā)明了含離子型親水基又有非離子型親水基的混合型去垢劑。在這五種類型的去垢劑中，混合型垢劑垢一般不常用，而陽離子型去垢劑不可以用于SDS-PAGE(因為它們會使蛋白質(zhì)帶上正電荷，電泳習性和SDS-PAGE原理相前背)，所以實際上用于蛋白質(zhì)提取的去垢劑只有陰離子去垢劑、兩性離子去垢劑和非離子型去垢劑，它們的代表試劑如下：
陰離子去垢劑：SDS（十二烷基磺酸鈉）、DOC（脫氧膽酸鈉）、SLS（十二烷基肌氨酸鈉）
兩性離子去垢劑：CHAPS，Zwittergent系列
非離子型去垢劑：Triton X-100，Triton X-114，Tween-20 ，NP40，C8APG（辛基葡萄糖苷）
