1. 這兩天我做標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性關(guān)系還行, R平方0.998.但是擴(kuò)增效率只有80%,另外擴(kuò)增曲線也不是太光滑.
2. 我用SYBR作為熒光染料,樣品的熒光強(qiáng)度也挺低的,只有100-200左右
KEY :曲線不光滑有時(shí)跟染料的量相關(guān)，可以加大看看，或者就是擴(kuò)增產(chǎn)物太少了
１ＰＣＲ反應(yīng)效率差；
引物，試劑ＰＣＲ條件的原因．做realtime－pcr優(yōu)化體系很重要，你的擴(kuò)增效率低．可以增加Ｍg離子的濃度，如果其他條件都好了，還不行，那就是引物的原因，那你就只能重新設(shè)計(jì)引物了
２ＰＣＲ中混入影響反應(yīng)的物質(zhì)：
模板提取方法需要改進(jìn)，
３樣品稀釋不準(zhǔn)確呀：
這很重要，做標(biāo)準(zhǔn)曲線很多不好的時(shí)候，很多都是倍比稀釋的問題，正常情況１０倍比稀釋時(shí)，前后是相差３.３２個(gè)循環(huán)
熒光定量PCR的靈敏度:,key:對(duì)于染料法的熒光定量來說，Ct值在13～30之間比較準(zhǔn)確，30～33之間需要再次確認(rèn)，在以上范圍內(nèi)的置信度比較差.
標(biāo)準(zhǔn)曲線要重復(fù)兩三次嗎???key:沒有人說做定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線要重復(fù)兩三次，只是用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度點(diǎn)最好不要少于4個(gè)，否則標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性不高.
關(guān)于熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作: key:一般的儀器雖然生成能進(jìn)行單拷貝檢測，單如果不是特別設(shè)計(jì)的體系，很難做到100拷貝以下的準(zhǔn)確定量，一般用來做標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小濃度為1000拷貝，在往下可靠性就降低了，這不是稀釋或其他什么問題，而是本身你選作標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度以及定量濃度最好不要低于1000拷貝，如果再低一點(diǎn)，100拷貝也勉強(qiáng)可以接受，否則即使你做出來，認(rèn)可度也不會(huì)太高
溶解曲線高矮:key:Tm值相同，而峰高低有差異是表達(dá)豐度不同，同樣的擴(kuò)增產(chǎn)物也會(huì)出現(xiàn)Tm值有微小差異，一般差異在1度以內(nèi)都可以接受。
融解曲線的縱坐標(biāo)表示熒光信號(hào)對(duì)溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)。
定量PCR沒有擴(kuò)增:key: 把定量PCR的產(chǎn)物跑個(gè)電泳，看看有無產(chǎn)物，如果電泳有條帶，說明PCR是成功的，只是熒光信號(hào)沒有讀取到，這時(shí)要調(diào)整染料或探針的濃度（看你是染料法還是探針法）；如果電泳沒有條帶，那么還要在定量PCR儀上優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。雖然你在普通PCR儀上優(yōu)化過條件，但換了定量PCR儀，由于兩臺(tái)儀器的升降溫速度及溫度精密度等指標(biāo)存在差異，同樣的條件做不出PCR也是可能的
由于很多因素的影響擴(kuò)增子的溶解溫度會(huì)有一定變異。溶解溫度會(huì)受特殊緩沖液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl2濃度和其他因素的影響。要做溶解曲線的對(duì)比你首先要確保所用的條件相同
SG的穩(wěn)定性如何？
key:只要不進(jìn)行稀釋，SG是非常穩(wěn)定的。一旦稀釋，可以保存1周到3個(gè)月，這取決于凍融次數(shù)，推薦配置成一定濃度的貯存液，用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配稀釋液。
為優(yōu)化SG反應(yīng)，有必要在所有的常規(guī)步驟來確定，優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)的條件（合適的MgCl2, dNTP和Taq酶濃度等）。結(jié)果應(yīng)該在凝膠電泳上有唯一的條帶。
SG分析的優(yōu)化主要包括以下4個(gè)因素：
a) SG 濃度
b) 引物濃度
c) MgCl2濃度
d) 溫度和反應(yīng)次數(shù)
推薦的SG終濃度變動(dòng)范圍是1：5000到1：100000。 經(jīng)常用到的濃度范圍是1：10000到1：70000。
引物濃度的優(yōu)化應(yīng)該測試不同濃度的正向和反向引物。引物濃度的范圍應(yīng)該是50nM到 300nM，然而，也有例外的情況。
熒光定量污染解決辦法：
Keykey:幾個(gè)月前我也有跟你一樣的遭遇，當(dāng)時(shí)跳樓的心都有。后來美國來人給培訓(xùn)，按照他們的要求，污染果真就給控制了，兩個(gè)月來一直還很好。以下的經(jīng)驗(yàn)希望對(duì)你有用。
1.配反應(yīng)體系和加模板要在不同的屋子進(jìn)行；
2.配體系的屋子準(zhǔn)備一件干凈的白大衣，每次進(jìn)去都要記得換白大衣，至少要把別的屋子穿的白大衣脫掉；
3.分裝好體系以后把反應(yīng)板/條放在一個(gè)有蓋的干凈的托盤中端到加樣的房間；
4.配體系戴的手套可以帶到加樣的房間，反過來不可；
5.PCR完畢后，反應(yīng)產(chǎn)物拿到別的屋子扔掉；
6.最重要的就是不要把DNA帶到配體系的屋子，以上幾點(diǎn)也都是為了這一目的。
熒光定量real-timePCR重復(fù)性問題：key: 建議不要只加1 ul，而是稀釋10倍左右然后加10 ul，這樣有助于改善重復(fù)性.
如果你測的是拷貝數(shù)，重復(fù)性不好是很難避免的。我感覺用SYBR green作realtime的誤差還是比較大的，它的優(yōu)勢在于靈敏度高，但如果想精確定量，還是比較困難的，只好重復(fù)很多次，或者多花錢買標(biāo)記的引物，那個(gè)特異性最好
各位高手，今天第一次做完8個(gè)基因的相對(duì)熒光定量（ddct法），擴(kuò)增時(shí)忘了做融解曲線了，現(xiàn)在是不是沒法再做融解曲線了？（ABI7500）對(duì)于每個(gè)基因都作了NTC對(duì)照，結(jié)果顯示NTC無擴(kuò)增，這樣能否說明引物設(shè)計(jì)得還可以，沒有引物二聚體的產(chǎn)生？至于是否有非特異性產(chǎn)物，就必須得做融解曲線了？請(qǐng)幫忙指教一下啊 key key: 把你的定量PCR產(chǎn)物重新作融解曲線，只是新建立一個(gè)反應(yīng)，反應(yīng)條件按照融解曲線的條件設(shè)定就可以了，沒必要重新作定量。Ct值25-29，融解曲線單峰；ntc無CT值，融解曲線無峰，就不用電泳了，可以肯定。模板量增加10倍，Ct值減小3.32Cycles
熒光閾值高，怎么改進(jìn)？key: 閾值取決于基線，基線是3-13cycles左右的熒光信號(hào)值標(biāo)準(zhǔn)偏差10倍，可能是背景高，把模板純化一下看看。要調(diào)整一下你的基線的起止循環(huán)數(shù)。一般開始的循環(huán)為2或3，中止循環(huán)為一次試驗(yàn)最早起峰的Ct－3，即如果一條曲線在第13個(gè)循環(huán)就已經(jīng)起峰了，那么基線的中止循環(huán)可以設(shè)置為13－3＝10。如果你的體系不存在問題，就可能是你的那次試驗(yàn)?zāi)０鍧舛容^高，起峰早，導(dǎo)致的閾值線過高。
熒光定量PCR檢測靈敏度和線性范圍的關(guān)系key:一般大家認(rèn)為的檢測靈敏度即檢測下限,可以理解為能檢測到和準(zhǔn)確定量的最低濃度(拷貝數(shù)),而線性范圍為能夠檢測的區(qū)間,即可以檢測及分辨的最低濃度到最高濃度的數(shù)量級(jí).但兩者都與熒光定量PCR儀器及試劑體系相關(guān).
real time PCR CT值一般在多少后認(rèn)為模板沒擴(kuò)增？key: 當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35個(gè)時(shí)，RealTime RT-PCR檢測無效，基因沒有表達(dá)；當(dāng)進(jìn)入對(duì)數(shù)的循環(huán)數(shù)在32-35個(gè)循環(huán)時(shí)，需要有至少3個(gè)重復(fù)才能判斷是否能檢測到基因的表達(dá)。
正常情況NTC是不應(yīng)該出現(xiàn)CT值的嗎？key key: 如果是探針法，應(yīng)該沒有Ct值，所謂的沒有，也是針對(duì)不同算法而言的。NTC一般沒有明顯的指數(shù)擴(kuò)增，所以一般軟件不計(jì)算Ct。
如果是染料法，可能在30個(gè)循環(huán)后有微弱起峰，并且軟件計(jì)算出Ct值，這時(shí)還要觀察溶解曲線，看擴(kuò)增產(chǎn)物是否是引物二聚體。大多情況是二聚體，這時(shí)也可以優(yōu)化條件，比如提高退火溫度等。
如果是探針法陰性對(duì)照起峰肯定是污染,如果是染料法,還要看溶解曲線;
如果溶解曲線的Tm值在80度以下,那么很可能是引物二聚體,如果溶解曲線是雙峰或更多峰,其中有與加模板后的擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值相同的峰,那么就意味著存在污染.
為什么熒光的增加值總是很低keykey如果是探針法陰性對(duì)照起峰肯定是污染,如果是染料法,還要看溶解曲線;如果溶解曲線的Tm值在80度以下,那么很可能是引物二聚體,如果溶解曲線是雙峰或更多峰,其中有與加模板后的擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值相同的峰,那么就意味著存在污染.
real time PCR無結(jié)果，而用產(chǎn)物跑電泳條帶很清楚，什么問題？key key: 我也出現(xiàn)過此情況，后來發(fā)現(xiàn)是因?yàn)榧訕拥臅r(shí)間太長了，熒光染料暴露時(shí)間太長了，熒光基團(tuán)淬滅了，出現(xiàn)上述問題還有一種情況，那就是熒光PCR儀的熒光采取信號(hào)值太低，有時(shí)也不穩(wěn)定. 如果你使用探針法，有熒光信號(hào)而沒有求出Ct值，那么可能你的探針濃度有問題，可能太高或者太低了，可能改變探針濃度看看。
最佳熒光采集溫度 key key: 采集熒光的時(shí)機(jī)不是決定于溫度，而是決定于采用的方法。
如果采用染料法，一般要在延伸階段的末點(diǎn)進(jìn)行檢測，而72度延伸的效率最高，所以采用染料法時(shí)大多在72度檢測。如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在引物二聚體，也有采用更高的讀板溫度，比如76度、80度等，這時(shí)的讀板溫度與引物二聚體的TM值相關(guān)。
如果采用TaqMan探針法，由于TaqMan探針是累積熒光，理論上說在任何步驟檢測都可以，但目前TaqMan大多采用兩步法，所以在退火的末點(diǎn)進(jìn)行檢測即可。
如果采用分子信標(biāo)的方法，就要在退火的末點(diǎn)進(jìn)行檢測。
如果采用FRET探針法，要在退火時(shí)進(jìn)行熒光檢測。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的討論 key key: 有一點(diǎn)可以告訴你:樣品濃度太高,beta-actin都是很高的,要漂亮就稀釋1000倍后再做.濃度高,很容易導(dǎo)致污染.而且第一二個(gè)梯度沒有分開啊.
標(biāo)準(zhǔn)曲線的落點(diǎn)局限在15個(gè)循環(huán)以前,那樣你得到的反應(yīng)有效線性范圍太窄,就是說要很高濃度的樣品才適用你這標(biāo)準(zhǔn)曲線.
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定量PCR中，質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)分子為何要線性化key key: 因?yàn)槟阋獧z測的目的基因如果不出以外的話，應(yīng)該是線性的吧，而你用來定標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的基因確是連接在環(huán)狀的質(zhì)粒上的。我想單從變性和復(fù)性的難易上就會(huì)有很大的區(qū)別，當(dāng)然會(huì)對(duì)引物的結(jié)合等個(gè)方面造成影響，何況環(huán)狀的空間構(gòu)象和線性的空間構(gòu)象上的差異了。做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的基本原則之一就是要盡量的模仿需要定量的基因所在的自然條件，所以說，如果做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)你可以有條件做到用和你要檢測的基因一樣的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線的話，就不要選擇把一段基因克隆到質(zhì)粒上。但是一般情況下是很難做到的。樓上說的沒有酶切效果還行，那只是還行。熒光定量本來就是很容易受到很多因素影響的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)然是要求嚴(yán)點(diǎn)好了，當(dāng)然如果你檢測的基因本身就是環(huán)狀的，那當(dāng)然不用線形化了，那樣反而不好了 呵呵
線性化比較麻煩：首先要酶切，保證完全酶切，才能全部線性化。然后要回收，質(zhì)粒酶切后在回收容易被破壞，而且回收率也不是很高。第三，線性化的質(zhì)粒不容易保存，相對(duì)于環(huán)狀質(zhì)粒來說。
所以，如果有實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明不線性化的質(zhì)?？梢杂?，那就可以省去很多事情了。
Fig. 6 also shows the efficiency of the PCR reaction is not altered by using circular plasmid DNA in place of linearised plasmid DNA.線形化與環(huán)狀質(zhì)粒比較文章
評(píng)論：這篇文章用這個(gè)質(zhì)粒對(duì)線性化和非線性化做了比較，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看線性化并沒有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生任何改變。但是這篇文章只是擺出了試驗(yàn)結(jié)果，并沒有從原理上分析這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因，因此線性化對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用并不能以這篇文章的結(jié)果來外推。就是說可能需要更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，或者從原理上分析了這篇文章的結(jié)果，才能得出結(jié)論來說明，線性化確實(shí)對(duì)于所有,或大部分的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子是不必要的。
realtime pcr不同基因之間的閾值(threshold)是不是要一樣阿key key: 如果做標(biāo)準(zhǔn)曲線或者相對(duì)定量，建議閾值還是一樣比較好。而且閾值一般要放置于擴(kuò)增曲線的指數(shù)段，即熒光數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)坐標(biāo)軸下的線性段。如果擴(kuò)增曲線的效率接近，閾值線的位置對(duì)于定量結(jié)果的影響是微乎其微的。
擴(kuò)增曲線本底不斷升高是什么原因 key key: 我近期也遇到過這種現(xiàn)象，現(xiàn)在基本解決了，原因可能如下：
1、試劑質(zhì)量差是主要原因，我用ABI的SYBR試劑做了一年從來沒有遇到過類似問題，而近期換成東洋紡的試劑就出現(xiàn)了這個(gè)問題
2、模板不純是一個(gè)重要原因，我用東洋紡的試劑出現(xiàn)問題后，用ddH2O稀釋10倍以上（一定不要用TE稀釋，要不然可能會(huì)更差），問題基本解決；
3、如果模板稀釋后基線還有一定的上升，結(jié)果分析時(shí)可以將基線從6以上設(shè)，避開初始的幾個(gè)上升厲害的循環(huán)；
建議：要根本解決此問題請(qǐng)用質(zhì)量可靠的試劑，便宜沒好貨！
分子信標(biāo)做的陰性對(duì)照，曲線為一條斜線，什么原因？keykey: 和我以前做得沒消除背景的曲線挺相像
很可能是試劑的問題，我用東洋紡的試劑也得到過類似的曲線，換了試劑就好了！探針設(shè)計(jì)的問題！ 還有反應(yīng)液體試劑酶離子調(diào)整.
標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測限key key: 這是由于ABI儀器采用半導(dǎo)體加熱，其邊緣效應(yīng)致使96孔加熱模塊的中央溫度高，周邊溫度低。由于定量原理是通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣本之間的比較來進(jìn)行的，所以各孔位的反應(yīng)參數(shù)可比性決定了定量的準(zhǔn)確性。在模板濃度低的時(shí)候ABI的儀器各孔位熱循環(huán)不均導(dǎo)致的誤差經(jīng)過多個(gè)循環(huán)后被放大，最終影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以ABI儀器只能區(qū)分5000個(gè)拷貝和10000個(gè)拷貝的差異，而且必須用ABI的原裝試劑才能達(dá)到此效果，如果將模板再稀釋，就無法區(qū)分這2倍濃度差異了。你加入起始模板數(shù)分別是1000 100 10copy/ul 的反應(yīng)孔，模板濃度太低了，ABI7000儀器不能檢測出來，建議用高濃度模板來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
雖然現(xiàn)在的定量PCR儀好多都宣稱能做到單拷貝檢測,但這個(gè)前提是非常苛刻的。需要模板,引物,體系,實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置一切都是最優(yōu)的情況下才可能做出來,而且一般還有比例.像一般低拷貝檢測Ct值不準(zhǔn)確的情況還是很正常的,不需要郁悶的說,大家都是這樣.一般臨床檢測的下限不會(huì)低于100拷貝,所以你要考慮是不是真的要做低拷貝的檢測,另外,當(dāng)Ct值大于30的時(shí)候結(jié)果就存在很大的不可信性,要反復(fù)確認(rèn),而低拷貝的Ct值一般都會(huì)大于30.
熔融曲線3個(gè)峰: key key:如果出現(xiàn)引物二聚體,可以從實(shí)驗(yàn)條件和體系上加以優(yōu)化,比如提高退火溫度,降低引物濃度等.但如果非特異性的峰離目標(biāo)產(chǎn)物的峰較近的話,那就需要重新設(shè)計(jì)引物了，從引物的設(shè)計(jì)上多做些考慮.
可以先優(yōu)化條件,如果沒有用的話就試試改變引物.
引物二聚體的幾個(gè)特征是溶解曲線的峰不明顯,即峰不尖且不高,另外是溶解溫度基本上低于80度.如果不符合上面的兩個(gè)條件,基本上就是體系污染了.可以跑個(gè)電泳看看.
樣本出現(xiàn)雙峰,也可以按照上面的判斷看看是否有引物二聚體還是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物.
可以提高2度退火溫度試試看,延長退火時(shí)間對(duì)于消除引物二聚體的作用不大.
基本上采用染料法的確容易出現(xiàn)引物二聚體,尤其是30個(gè)循環(huán)之后.如果提高退火溫度后空白對(duì)照還是起峰,但Ct值在35之后,那就不要管他了,正常.
你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果其實(shí)很好，是初始模板濃度設(shè)置錯(cuò)了。
1.以2倍梯度稀釋的模板，Ct值的差異為1的時(shí)候擴(kuò)增效率為100％，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上來看，你的6個(gè)模板Ct差異（標(biāo)準(zhǔn)曲線橫軸）還都在1以上一點(diǎn)，已經(jīng)很好；
2.你的模板是以2倍梯度稀釋的，這樣初始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值每個(gè)濃度相差應(yīng)該在0.3左右，從圖中看，標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱軸每個(gè)梯度相差在0.7左右，似乎你設(shè)置時(shí)初始模板的拷貝數(shù)是按照5倍梯度設(shè)置的。你可以把Ct值取出來，根據(jù)初始模板自己做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線看看，估計(jì)擴(kuò)增效率可以達(dá)到90％以上。2倍梯度區(qū)分的很好！
只要Ct值大于30都是陰性嗎？一開始不用設(shè)定嗎？key key: 看你做什么檢測了，還要與對(duì)照品比對(duì)才能定性分析。不過，一般Ct值大于30結(jié)果置信度降低，需要多次確認(rèn)。
關(guān)于熒光收集階段：key key: 看你采用的是哪種方式：
1.SYBR Green法，從原理上來說檢測的是累積熒光，所以在變性、退火和延伸階段檢測都可以，不過由于染料法的特異性不好，一般會(huì)在延伸的末點(diǎn)進(jìn)行檢測，或者根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值再設(shè)定一個(gè)更高的檢測溫度已規(guī)避非特異性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果的影響；
2.TaqMan探針法，在延伸末點(diǎn)檢測較為準(zhǔn)確，不過一般采用兩步法居多，這時(shí)可以在退火的末點(diǎn)進(jìn)行檢測；
3.FRET法，由于原理的限制，要求在退火末點(diǎn)檢測；
4.分子信標(biāo)，根據(jù)機(jī)理，在退火末點(diǎn)進(jìn)行檢測。
常規(guī)修飾基團(tuán)分子量
5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
1. 內(nèi)參基因和目的基因有差距，并不影響realtime 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，
2.樣本中內(nèi)參和目的基因本身的表達(dá)相差大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)時(shí)起飛點(diǎn)不一致，另外，內(nèi)參沒有到達(dá)平臺(tái)期，也沒有影響，之所以出現(xiàn)這種情況，可能是引物濃度偏高，再加上樣本中內(nèi)參基因本身表達(dá)偏高
3.兩者圖片，一直是擴(kuò)增曲線原始圖，一張是軟件分析后的圖。
2. 1.一般ABI的儀器起跳循環(huán)數(shù)好像是15-35個(gè)比較可靠一些,但超出這個(gè)范圍多少意義不大我也不清楚,我想是和儀器有關(guān)系
2.一般光滑S形擴(kuò)增曲線就是比較好的了,我看你的挺好
3.閾值國內(nèi)試劑一般要求CT大于6,不是盡可能小
4.我CDNA量比較少，增加PCR的模版量很困難，不知可否把引物、探針及Buffer的量等比減少，來相對(duì)增加模版量呢？- 我覺得就是改變體系,那的從新摸條件,可以試試,但我覺得你現(xiàn)在的挺好,不知你跑電泳看了嗎?建議不要更改
我覺得是這樣,不知大家和你的意見咋樣
3. 1.你說gapdh起跳晚,我看不晚,這是基因表達(dá)量決定的,不知你哪條是標(biāo)準(zhǔn)品以及標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)是多少,可以分析一下,表達(dá)量是多少,但一般就是你這個(gè)范圍起跳,表達(dá)量大概就是10^6-10^7左右,起跳的早晚不是你能調(diào)整的(當(dāng)然標(biāo)準(zhǔn)品是可以調(diào)整的)
2.你要他們之間差距不那么大也是不現(xiàn)實(shí)的,一般都要有差距的,因?yàn)镚APDH的表達(dá)豐度多高于目的基因,這很正常
3.GAPDH起跳早，但40個(gè)循環(huán)達(dá)不到平臺(tái)期及目的基因起跳晚，但很快就到達(dá)平臺(tái)期,只要你加樣等操作沒問題,這并不影響數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì),不用調(diào)整
我是這樣認(rèn)為的,不知大家有何高見
半對(duì)數(shù)圖
Keykey:那是開始的時(shí)候熒光強(qiáng)度波動(dòng)造成的,正?，F(xiàn)象.都會(huì)有的.開始的時(shí)候SYBR 也會(huì)結(jié)合一些雙鏈的,所以會(huì)發(fā)光.但不穩(wěn)定.也就是初始階段的波動(dòng),所以基線(baseline),不會(huì)從1開始,一般從5左右,那時(shí)候熒光強(qiáng)度穩(wěn)定.
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樓主的第一種溶解曲線有少量特異產(chǎn)物，所以說是少量，因?yàn)樘禺惍a(chǎn)物的溶解曲線峰值相對(duì)雜帶的峰值不是很高。
第二種溶解曲線明顯有雜峰，但尚不能斷定哪個(gè)是，因?yàn)楦鶕?jù)個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，引物二聚體多容易在75度左右出現(xiàn)溶解曲線，而樓主的溶解曲線最低溫度也在80度。
第三個(gè)沒有特異性產(chǎn)物，只是一些smear,因?yàn)闆]有特異的溶解峰出現(xiàn)。如果可以排除試劑問題，考慮出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因有兩種：
1. cDNA完整性差，可以從改善RNA提取及RT過程來解決，
2. 引物的特異性差，建議更換引物，個(gè)人體會(huì)如果引物的特異性差，無論如何優(yōu)化條件都不會(huì)得出太令人滿意的結(jié)果，遇到這種情況，我一般都是更換引物。
樓主不妨用用同實(shí)驗(yàn)室別人用著好用的引物擴(kuò)增一下自己的 cDNA，基本就可以判斷出自己RT產(chǎn)物的好壞了。
同樣，樓主也可以用一下別人擴(kuò)增非常成功的cDNA來當(dāng)模版，用自己的引物擴(kuò)增一下，就可以知道自己的引物如何。
另外還有一點(diǎn)，就是對(duì)樓主的PCR程序設(shè)計(jì)有些不解，為何在一個(gè)循環(huán)中要進(jìn)行3 次讀板，這樣出來的擴(kuò)增曲線會(huì)不會(huì)在三個(gè)溫度間互相干擾，因?yàn)樵趩瓮ǖ赖那闆r下，每一個(gè)樣品只能出來一條擴(kuò)增曲線，這樣3次讀板形成的熒光值之間必定會(huì)互相影響，尤其是第一次的讀板溫度是68度，正好低于引物二聚體的解鏈溫度，這樣引物二聚體所產(chǎn)生的熒光就會(huì)影響真正的產(chǎn)物的熒光。
從樓主所作的溶解曲線來看，如果產(chǎn)物的解鏈溫度是85.3度，建議讀板溫度設(shè)在82-83度之間比較好，因?yàn)檫@時(shí)片段比較小的雜帶基本都降解了，雜帶所形成的熒光強(qiáng)度最小。而目的條帶幾乎沒有降解。
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樓主，你把所有的16個(gè)sample都設(shè)置成了標(biāo)準(zhǔn)品（即standard），那系統(tǒng)就會(huì)默認(rèn)將這16個(gè)結(jié)果都納入標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算中。
建議你在分析時(shí)，只取4-6個(gè)寬范圍的sample，在面板設(shè)置中設(shè)成standard，其他都設(shè)成unknown，然后再按那個(gè)分析的鍵。這樣標(biāo)準(zhǔn)曲線就應(yīng)該出來了。
標(biāo)準(zhǔn)曲線要做復(fù)管嗎？一般是2管還是3管？另外，文章發(fā)表前編輯審稿時(shí)需要看什么？謝謝！keykey: 當(dāng)然要做重復(fù)，一般三個(gè)就可以了。論文發(fā)表時(shí)，只需要處理后的結(jié)果，我們一般用柱狀圖加上error bar即可。不需要raw data的。
溶解曲線出現(xiàn)三個(gè)峰，以為是引物合成問題，重新合成三次引物，溶解曲線仍為三個(gè)峰。產(chǎn)物經(jīng)電泳證實(shí)卻為一條帶，為什么會(huì)出現(xiàn)這種結(jié)果？key key: 我也曾經(jīng)出現(xiàn)過這個(gè)問題，但是我是出現(xiàn)兩個(gè)峰，后來跑電泳證實(shí)是引物二聚體，〈100bp的地方隱約出現(xiàn)一個(gè)引物二聚體的條帶，你跑電泳沒有其他條帶可能是電泳的靈敏度不夠吧，還有引物產(chǎn)生二聚體也不一定只產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)的二聚體啊，可能會(huì)產(chǎn)生其他結(jié)構(gòu)的二聚體啊，建議你可以繼續(xù)設(shè)計(jì)引物再試試，或者提高退火溫度看看！你的單一條帶是不是很寬??？照?qǐng)D上看來你的非特異性的產(chǎn)物和你的目的產(chǎn)物差不多大。非特異性擴(kuò)增的條帶的Tm值和你的產(chǎn)物的還是有點(diǎn)接近。而且不一定是跑膠都能看到非特異性擴(kuò)增的。我以前做完后跑膠都沒有目的條帶，但是擴(kuò)增曲線還是不錯(cuò)，但是熒光值都比較低。實(shí)時(shí)定量還是很敏感的。
建議提高溫度，如果沒有目的條帶，就試著調(diào)一下鎂離子濃度。
最近作REAl－time PCR有幾個(gè)問題請(qǐng)教：
1. 產(chǎn)物可以進(jìn)行電泳檢測嗎？
KEYKEY：產(chǎn)物是可以用來電泳的，不過由于定量PCR借助于熒光的作用靈敏度較高，電泳產(chǎn)物則一般條帶不會(huì)很亮；
2. 為什么陰性產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增也有較強(qiáng)的熒光信號(hào)（據(jù)CT值可判為陽性）？且電泳似乎也有較量的條帶，無法與陽性產(chǎn)物區(qū)別。
KEYKEY：產(chǎn)物的二次擴(kuò)增在定量PCR中一般是不建議做的，原因很簡單，片段太短了，還是那個(gè)問題，定量PCR是高靈敏度的，再二次擴(kuò)增很難排除二聚體、PCR污染、操作誤差等等因素，特別是污染，我們能排除的往往都只是你想到的，還有很多是一時(shí)想不到的；如果陰性有擴(kuò)增，說明PCR體系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很難消除。
3.在CT值無法判斷陰性或陽性的情況下（接近或略高于判定陰性值時(shí)，有擴(kuò)增曲線，但CT值較大如37，38）如何下結(jié)論？KEYKEY：結(jié)論根據(jù)原來定的標(biāo)準(zhǔn)下，比如原來設(shè)定ct>35為陰性，那當(dāng)ct為36時(shí)就不要特意調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)。確定其為陰性就可以了。
4。陽性產(chǎn)物做模板ct較低，其原因是模板濃度較高，模板濃度的對(duì)數(shù)和ct成反比。所以，模板濃度越高，ct越低。
1、 2、3、如果你是用標(biāo)準(zhǔn)的檢測試劑盒，你只需要按說明書來就操作就可以，判斷結(jié)果同樣，如果你還想探究其中的陰性可能漏檢的問題，你應(yīng)該用其他方法，而不能用這個(gè)試劑盒了。
通過前輩的介紹了解到：正常的ct值范圍在18-30之間，ct值應(yīng)是熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù) 如果正常情況下大于30應(yīng)可以定為陰性。因?yàn)樽罱乙苍谟肧YBR Green做實(shí)時(shí)定量PCR, 所以也想向各位前輩請(qǐng)教一下有關(guān)Ct值的問題。我的結(jié)果中待測基因的Ct值大多在18-25之間，但唯獨(dú)內(nèi)參照的Ct值很低。第一次做時(shí)基本都在10左右，將模板稀釋10倍后第二次的內(nèi)參照的Ct值還是在12-14之間。以這樣的數(shù)據(jù)分析會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確度嗎？或者還是將模板繼續(xù)稀釋，直到ct值都達(dá)到18-30之間呢。KEY KEY: 沒必要吧一般ct超過30是不好,但要是三個(gè)重復(fù)都這樣,也還是可以用的啊,每次都做陰性對(duì)照。陰性對(duì)照ct為0，那ct30就肯定不是污染,而是基因表達(dá)量低或是模板太稀,內(nèi)參ct為10－14都正常啊,沒必要再稀釋模板了,那樣你的目的基因ct又要超過30了,不過內(nèi)參ct太低,低于10也是不太好,結(jié)果可能會(huì)有偏差.
real-time pcr結(jié)果可用來發(fā)文章的要求有哪些？KEYKEY：不用，但是在文章必須說明用電泳還是用溶解曲線檢測過。論文中把 你的實(shí)驗(yàn)方法說明白就可以了。簡單的一個(gè)表示圖，就可以發(fā)表了。不過REAL-TIME PCR 想用的話最好放溶解曲線圖，一般外文雜志喜歡接受。
不知道為什么這兩天做熒光老不順，熒光ＣＴ在２０以下產(chǎn)物檢測很亮，而普通用mix酶跑ＰＣＲ條帶卻很淡，難道是熒光定量的酶比較好的原因嗎？
另外我的ＮＴＣ熒光時(shí)在３０多個(gè)循環(huán)的時(shí)候都有起峰，我用重開的一管新酶和新稀釋的引物以及新水做，還是有起峰，實(shí)在是搞不懂了．求大家?guī)蛶兔Π桑?span style="color:red">KEYKEY：1 一些公司熒光定量試劑盒的酶是比普通Tag酶要好，主要是可以防止引物二聚體產(chǎn)生，引物二聚體少了，擴(kuò)增效率自然高了。
2 也可能是你熒光定量的體系比你普通的PCR體系要優(yōu)化，比如有些公司熒光定量mix中的Mg離子濃度要高于普通的PCR體系。
3 可能是跑膠的問題?？纯茨愕腗ARKER還和以前一樣亮嗎？
做熒光定量的短片段特別容易污染?？赡苁悄愕臉尡晃廴玖税桑怯玫呐茈娪镜哪前褬寙?？如果在35個(gè)循環(huán)后起峰，污染不算嚴(yán)重?？梢园褵晒舛縋CR的基線調(diào)節(jié)到恰好高過陰性對(duì)照。
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=7883753&sty=1&tpg=21&age=0
看你用的是MJ的opticon系列了。不清楚你的條件，但是從擴(kuò)增曲線上看
1、熒光強(qiáng)度都是0.001-0.01的，這有點(diǎn)太小了。擴(kuò)增效率很低
2、你的baseline是如何扣除的？扣除方法可能影響你的曲線。建議你扣除5-15循環(huán)的avarage
3、melting curve雖然看起來是很好的結(jié)果，但是還建議你電泳下看看。
請(qǐng)問下現(xiàn)在的PCR熒光診斷試劑盒里面，國家規(guī)定都要求要有臨界陽對(duì)照嘛？
這些對(duì)照品是不是一定要和樣本一起提取呢？
還有臨界陽用陽性對(duì)照來稀釋來得到可以嘛？ 不知道要怎么稀釋比較好呢？
KEY KEY: 陽性對(duì)照和陰性對(duì)照必須要和樣品一起提取，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，這樣才有作為對(duì)照的意義。
臨界陽性樣品是不能通過陽性對(duì)照稀釋的，除非你知道臨界陽性的濃度，經(jīng)過定量標(biāo)定將陽性對(duì)照稀釋到臨界陽性。
本人檢測的目的基因共有5個(gè)處理，每個(gè)處理做兩次重復(fù)，現(xiàn)在的問題每個(gè)處理內(nèi)重復(fù)性非常差，有的Ct值差異達(dá)到了10，不知道是怎么回事？
KEYKEY：換了一個(gè)退火溫度把所有的設(shè)計(jì)好的引物都拿來重新試了一下，現(xiàn)在有一對(duì)引物兩個(gè)溫度都還好?；旧夏軌蜻_(dá)到要求了。
另外，我使用的是BIO-RAD的儀器，感覺邊上跟中間溫度差異挺大的，因?yàn)橹斑@對(duì)引物我也曾經(jīng)試過的，但是放在邊上了一個(gè)，結(jié)果差異很大。經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)?。?/strong>
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=7789235&sty=1&tpg=23&age=0熒光量開始很高
keykey根據(jù)TAKARA的資料說,這是因?yàn)槊鍧舛冗^大了,把它在稀釋,然后再做看看. 是模板濃度過大引起的，可以看到曲線圖中最高濃度的樣品的CT值很小。但是這張圖也能用的，你調(diào)整一下基線范圍，把背景熒光壓下去，這樣以來圖就漂亮了就能分析了。
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=7754719&sty=1&tpg=24&age=0
剛做了一次real time PCR,結(jié)果解離曲線中出現(xiàn)了負(fù)值keykey?!?: 這個(gè)曲線反應(yīng)的是隨著溫度的變化,熒光值的變化速率.值越高,則此時(shí)PCR產(chǎn)物熒光值變化越快,也就是說PCR產(chǎn)物變性速度最快.
當(dāng)溫度達(dá)到Tm值時(shí),PCR產(chǎn)物迅速變性,熒光值急劇下降,表現(xiàn)在這張圖上就是出現(xiàn)一個(gè)峰.產(chǎn)物越純,峰越窄,PCR產(chǎn)物越多,峰越高.這樣看來,出現(xiàn)負(fù)值表明此溫度下PCR產(chǎn)物變性速度沒有兩邊的溫度是快.70-80度時(shí),已經(jīng)出現(xiàn)變性,但是較為緩慢.但是你的產(chǎn)物看來不是特別純,峰比較寬,可能要改變反映條件或者改變引物.
請(qǐng)教大家，我用sybgreen，擴(kuò)增目的片斷60bp realtime pcr,ct 值17~22之間，溶解曲線看每個(gè)樣本都是單峰，blank無擴(kuò)增，電泳檢測也是單條帶?？雌饋磉€可以，只是總發(fā)現(xiàn)單峰的寬度（peak width）在3.3~4.0之間，而以前做其他的基因擴(kuò)增單峰都是很窄的，大約1.2左右。請(qǐng)問大家，峰較寬說明什么？和片斷的長度有無關(guān)系？這樣的結(jié)果可否接受，如果不可怎么改進(jìn)？??????
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