作者：解螺旋.子非魚
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在qPCR中會與各式各樣的曲線打交道，每種曲線都有其不同的意義，甚至能夠通過看曲線來發(fā)現(xiàn)實驗中的一些問題。
我們知道PCR的本質(zhì)其實就是一變二、二變四、四變十六······產(chǎn)物呈指數(shù)增長的數(shù)字游戲。
因此，在引物、模板、緩沖液、酶等都充足的理想狀態(tài)下，熒光定量PCR的擴增曲線應(yīng)該是這樣的：
然而，理想很瘋狂，現(xiàn)實卻很“性感”，看下面的“S型”曲線就知道，相對于理想狀態(tài)下的擴增曲線，在dNTP和酶都有限的情況下，擴增曲線如下圖所示，有一個平臺期，酶逐漸失活，dNTP消耗殆盡，產(chǎn)物增加量逐漸減少；直至沒有任何產(chǎn)物生成，數(shù)目保持恒定。
熔解曲線(Dissociation curve)，就是隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。擴增反應(yīng)完成后，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生熔解曲線。熔解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50％的溫度），用這個特征峰就可以將特異產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因為它們在不同的溫度熔解度不一樣。用熒光信號改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)（dR/dT）與溫度作圖，得出熔解曲線。
dR/dT 越大，表明熒光值變化最快。隨著溫度上升，達到Tm點時，大部分產(chǎn)物雙鏈DNA解開，熒光值下降非常快。如果qPCR產(chǎn)物非常特異，熔解曲線在80-90之間會形成一個單峰(溫度和qPCR產(chǎn)物長度以及GC含量相關(guān))。
正常情況下，熒光定量PCR的產(chǎn)物是特異的，這時的熔解曲線應(yīng)該是這樣的：
當(dāng)然，也會有不正常的時候，熔解曲線前置雜峰，在主峰前有一個前鋒，敢在主峰面前“撒野”的是比目的片段短些的非特異性片段，在溫度低一些的時候就能解開雙鏈，也可能是引物二聚體。
不正常的情況下，還可能出現(xiàn)熔解曲線后置雜峰，躲在主峰后面的是比目的片段長些的非特異性片段，在溫度高一些的時候才能解開雙鏈。
再來欣賞一下那些形狀特異的擴增曲線：
沒有對數(shù)增長期，可能是模板濃度高，這樣所看見的擴增曲線，就不是在一個對數(shù)期。
無CT值，可能原因及對策：
檢測熒光信號的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時采集，Taqman 法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。
引物或探針降解：可通過 PAGE 電泳檢測其完整性。
模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct >38），可能原因及對策：
擴增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計更好的引物或探針，改用三步法進行反應(yīng)。適當(dāng)降低退火溫度，增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。
PCR 產(chǎn)物太長： 一般采用 80-150 bp 的產(chǎn)物長度。
