DNA甲基化有足夠的潛力作為癌癥的生物標(biāo)志物，用于篩查、預(yù)后以及療效監(jiān)測(cè)。在表觀(guān)遺傳中，最常見(jiàn)的甲基化修飾就是胞嘧啶甲基化和羥甲基化，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）。已有研究表明，異常的5mC和5hmC模式是癌癥的典型特征。【更多DNA甲基化測(cè)序信息參見(jiàn)測(cè)序中國(guó)《2019 DNA甲基化與癌癥早篩專(zhuān)題報(bào)告》，詳情見(jiàn)文末】
目前，亞硫酸氫鹽測(cè)序是DNA甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。幾十年來(lái)，生物學(xué)家多是依靠亞硫酸氫鹽來(lái)檢測(cè)5mC和5hmC。但這種測(cè)序方法仍有極大的限制，由于亞硫酸氫鹽對(duì)DNA的降解率達(dá)99％，在處理有限的樣本時(shí)（如血液中的cfDNA），亞硫酸氫鹽測(cè)序?qū)⒆兊梅浅＞哂刑魬?zhàn)性。此外，亞硫酸氫鹽測(cè)序是間接檢測(cè)5mC和5hmC。由于未修飾的胞嘧啶約占人類(lèi)基因組總胞嘧啶的95％。將所有未修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶會(huì)嚴(yán)重降低序列復(fù)雜性，導(dǎo)致測(cè)序質(zhì)量差，定位效率低，基因組覆蓋不均勻和測(cè)序成本增加，這極大地限制了表觀(guān)遺傳的研究應(yīng)用。
圖1. 宋春嘯（左）和Benjamin Schuster-Boeckler（右）。來(lái)源: LUDWIG CANCER RESEARCH
為準(zhǔn)確檢測(cè)DNA甲基化水平，最好的方法就是在不影響未修飾胞嘧啶和高分辨率的前提下，直接檢測(cè)5mC和5hmC。2月25日，牛津大學(xué)路德維格癌癥研究所宋春嘯和Benjamin Schuster-Boeckler在Nature Biotechnology發(fā)表文章，報(bào)道了一種新的DNA甲基化測(cè)序方法：TET輔助吡啶硼烷測(cè)序（TET-assisted pyridine borane sequencing，TAPS）。與亞硫酸氫鹽測(cè)序相比，TAPS無(wú)需亞硫酸氫鹽，可對(duì)目標(biāo)序列直接進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序，是一種破壞性更小、效率更高的單堿基分辨率DNA甲基化測(cè)序方法。
傳統(tǒng)的DNA甲基化測(cè)序多是將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，新開(kāi)發(fā)的TAPS“反其道而行之”，可在不影響未修飾胞嘧啶的前提下，實(shí)現(xiàn)5mC和5hmC的直接檢測(cè)。TAPS方法包括兩個(gè)步驟：首先利用TET酶將5mC和5hmC轉(zhuǎn)化為第三種修飾，即5-羧基胞嘧啶（5caC）。然后，利用宋春嘯教授實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的一種新化學(xué)反應(yīng)，將5caC轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，就可以通過(guò)普通測(cè)序儀直接測(cè)序。
研究數(shù)據(jù)顯示，TAPS能夠以高靈敏度和特異性檢測(cè)DNA甲基化，保留DNA片段可超過(guò)10kb。同時(shí)，研究人員還基于TAPS開(kāi)發(fā)了兩種新方法：TAPS-β和CAPS，它們分別僅用于檢測(cè)5mC或5hmC。
圖2. Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，TAPS僅將5mC轉(zhuǎn)換為T(mén)（左圖）；通過(guò)HPLC-MS / MS定量dC和各種胞嘧啶衍生物的轉(zhuǎn)化率（右圖）。
圖3. TAPS，TAPS-β和CAPS方法概述。
TAPS測(cè)序會(huì)產(chǎn)生一種新型數(shù)據(jù)，對(duì)此，研究人員針對(duì)性開(kāi)發(fā)了數(shù)據(jù)分析所需的計(jì)算方法。與亞硫酸氫鹽測(cè)序相比，TAPS數(shù)據(jù)的處理速度不僅快了2倍，而且還能保留樣本更多的原始信息，使得在DNA甲基化檢測(cè)中，基因突變檢測(cè)和結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)變得更加容易。
試驗(yàn)中，研究團(tuán)隊(duì)將TAPS應(yīng)用于小鼠胚胎干細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序。結(jié)果表明，使用TAPS可檢測(cè)E14基因組42,741,339個(gè)CpG位點(diǎn)中的88.3％，而WGBS僅為77.6％。TAPS的覆蓋范圍更均勻，定位效率更高，可以生成更精確的測(cè)序數(shù)據(jù)。此外，TAPS測(cè)序成本僅為WGBS的一半。這意味著，耗費(fèi)同樣多的錢(qián)，TAPS可以獲得兩倍多的有效數(shù)據(jù)，有助于進(jìn)行更高質(zhì)量、更全面的基因分析。
圖4. 不同方法對(duì)E14基因進(jìn)行至少三次讀取的CpG位點(diǎn)覆蓋情況，包括僅使用TAPS方法，TAPS和WGBS，僅使用WGBS方法。
在證明TAPS方法起作用后，該團(tuán)隊(duì)又花了一年時(shí)間來(lái)完善，使其反應(yīng)效率從約70％提高到95％以上。目前，TAPS可與多種下游分析技術(shù)兼容，包括但不限于甲基化敏感性PCR、限制性酶切、質(zhì)譜、全基因組測(cè)序等，還可與其他測(cè)序方法結(jié)合，進(jìn)一步降低成本，提高分辨率。例如，TAPS可保留較長(zhǎng)DNA序列，因此與長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)（如SMRT測(cè)序和納米孔測(cè)序）結(jié)合或可用于研究某些此前難以研究的基因區(qū)域。此外，研究團(tuán)隊(duì)目前正在改進(jìn)TAPS，利用其檢測(cè)單細(xì)胞和血液中的ctDNA，以開(kāi)發(fā)微創(chuàng)、無(wú)創(chuàng)的癌癥診斷技術(shù)。
表觀(guān)遺傳修飾也被稱(chēng)為隱形標(biāo)記，可控制基因表達(dá)及其在基因組中的分布。深入了解表觀(guān)遺傳信息有助于研究跟蹤癌癥的發(fā)生進(jìn)展和抗藥機(jī)制。TAPS方法的開(kāi)發(fā)使表觀(guān)基因組測(cè)序更加準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)，也有利于DNA甲基化測(cè)序能更廣泛地應(yīng)用于學(xué)術(shù)研究和臨床。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，相信會(huì)有更多更好的甲基化測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)，取代亞硫酸氫鹽測(cè)序，成為表觀(guān)基因組測(cè)序的新標(biāo)準(zhǔn)。
參考資料：
1.A new sequencing method to detect DNA modifications of relevance to cancer
2.Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution
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