外泌體研究日益火爆，其主要思路就是在原來的分子研究基礎(chǔ)上加入外泌體分離、鑒定、功能驗(yàn)證環(huán)節(jié)，呵呵呵，一般來說是這樣子的。
今天我們就來看一篇復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，心內(nèi)科葛均波主任的一篇關(guān)于外泌體在血管疾病中的研究。
Exosomes derived from mature dendritic cells increase endothelial inflammation and atherosclerosis via membrane TNF-α mediated NF-κB pathway.（J. Cell. Mol. Med IF 4.8）
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還記得第四季，我們也講過一篇DC細(xì)胞與外泌體相關(guān)的文章嗎？
那篇文章講的是腫瘤細(xì)胞來源的外泌體能引發(fā)腫瘤抑制，主要是通過DC細(xì)胞攝入外泌體。這篇文章是講的是DC細(xì)胞分泌的外泌體能引起內(nèi)皮炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化。DC細(xì)胞在這兩篇文章中所參與的功能不同。
本文結(jié)合了兩個(gè)熱點(diǎn)：DC細(xì)胞、exosomes
1成熟的DC細(xì)胞促進(jìn)內(nèi)皮炎癥，并且外泌體參與該過程
DC細(xì)胞是一類免疫細(xì)胞，作為一個(gè)炎癥細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。
GW4869是一個(gè)外泌體分泌抑制劑，通常用來減少DCs細(xì)胞外泌體的釋放。
濾膜系統(tǒng)（transwell system），該濾膜能阻止比外泌體大的囊泡轉(zhuǎn)移。
作者通過濾膜系統(tǒng)共培養(yǎng)DC細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DCs細(xì)胞能促進(jìn)內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，而GW4869能減弱這種作用。這表明成熟DC細(xì)胞在促進(jìn)內(nèi)皮炎癥的功能上有外泌體參與。
2 培養(yǎng)DC細(xì)胞，分離鑒定外泌體
為了實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，排除可能是由胎牛血清中來源的外泌體，作者先從無血清培養(yǎng)基陪養(yǎng)DC細(xì)胞，確保外泌體的來源確實(shí)是DC細(xì)胞。通過一定時(shí)間的培養(yǎng)，最終通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)了相關(guān)DC細(xì)胞marker，qPCR、Elisa檢測(cè)了相關(guān)細(xì)胞因子，確定了培養(yǎng)的細(xì)胞為DC細(xì)胞。
這里作者使用了Exo-Quick外泌體分離試劑盒，進(jìn)行外泌體分離。通過電鏡分析，所獲得的囊泡大小在109nm，符合外泌體的典型大小特征。并且檢測(cè)了一些外泌體相關(guān)marker，確定了分離的囊泡為外泌體。另外，作者檢測(cè)了外泌體陰性marker，鈣連接蛋白來說明分離純度。這些數(shù)據(jù)都表明了從DC細(xì)胞中成功分離了外泌體。
3 外泌體功能驗(yàn)證
首先，在DC-exos上加上一個(gè)綠色熒光標(biāo)簽，把它跟內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞很快就能攝入加了標(biāo)簽的外泌體，并且隨著時(shí)間的推移，內(nèi)皮細(xì)胞能攝入越來越多的DC-exos。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成熟的DC外泌體能激活上皮細(xì)胞一些炎癥相關(guān)因子表達(dá)，而不成熟的DC細(xì)胞則起不到這樣的作用。
前期報(bào)道，DC-exos能通過膜TNF-α或攜帶的miRNAs來影響靶腫瘤細(xì)胞，而TNF-α能通過NF-κB通路激活內(nèi)皮細(xì)胞。另外LPS也能激活內(nèi)皮細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)表明，LPS處理內(nèi)皮細(xì)胞，能很快提升p-p105水平；DC-exos也能較快提升p-p105水平，這表明DC-exos能通過NF-κB通路激活內(nèi)皮細(xì)胞，這可能與外泌體膜蛋白及其受體相關(guān)。
接下來，作者做了一個(gè)時(shí)間相關(guān)性實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)，LPS、DC-exos都能很快上調(diào)p-p105水平，激活內(nèi)皮細(xì)胞，而且分別在4h（小時(shí)）時(shí)達(dá)到峰值。
4 TNF-α定位與功能驗(yàn)證
TNF-α定位于胞膜，并且實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于不成熟的DC來源的外泌體，成熟的DC-exos含有更多的TNF-α（這也就表明了為什么不成熟的DC 細(xì)胞外泌體不能激活內(nèi)皮細(xì)胞?。?/span>
通過干擾成熟DC細(xì)胞的TNF-α，發(fā)現(xiàn)其激活的內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子、p-p105表達(dá)量降低了；并且通過抑制TNF-α活性抗體孵育DC細(xì)胞，也能發(fā)現(xiàn)其激活的內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子、p-p105的表達(dá)降低。這表明，DC-exos膜高表達(dá)TNF-α能快速激活內(nèi)皮細(xì)胞。
5 外泌體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
小鼠實(shí)驗(yàn)過程跟細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一樣，開始先驗(yàn)證了動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞攝入實(shí)驗(yàn)標(biāo)記的外泌體。
通過每周一次注射20μgmDC-exos，持續(xù)12周，能增加ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化損失。
該文章，邏輯性很好。先驗(yàn)證了DC細(xì)胞功能，從外泌體抑制劑引發(fā)關(guān)注外泌體參與DC細(xì)胞功能。隨后分離、鑒定外泌體，驗(yàn)證外泌體功能，最后是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容比較順暢。機(jī)制部分未做，這也給后續(xù)埋下伏筆。
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