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開學(xué)伊始，總是伴隨著大量的工作，實驗，標(biāo)書，論文，文章。。。七頭八線(果子：這個詞語找不到，但是能理解意思)，說不得想要是有幾個分身便好了，提蛋白系列的結(jié)束也就意味著要開始用這些蛋白來做點事情，所以接下來的計劃是：

1. western blot 常規(guī)分子以及現(xiàn)在想到的注意事項，

2. western blot 小分子蛋白的分離和當(dāng)時想到的注意事項，

3. western blot 的條帶分析。

之前討論了提蛋白的方法，都是為了今天的western blot，一般做分子實驗肯定繞不開此項目，也是必須要掌握的，同時也是大家都很懂的，我也只是把自己平時遇到現(xiàn)在想起來的做個總結(jié)。

Western blotting 步驟如下：

• （1）洗板子：洗板子很重要，是開始做實驗的基礎(chǔ)，所以板子一定要洗干凈，如果8塊板子，認(rèn)認(rèn)真真洗15-20min，一定可以洗干凈。板子要當(dāng)天做完當(dāng)天洗，不要留到第二天。用洗潔精寫，不需要用布洗，直接帶丁晴手套或者蘆薈手套去搓，先洗四個邊，然后再用手搓中間，再用自來水沖洗，直到不掛水珠就可以了，如果實在不知道什么樣算可以，就用自來水正面來回沖30s，反面來回沖30s，一般都可以洗干凈。然后再用ddH2O沖洗，同上。我一般都會直接放在架子上，自己收起來，當(dāng)然放在烤箱也可以，但一定要記得收回來。為什么洗板子啰嗦這么久，是因為板子對實驗的成功也至關(guān)重要。

• （2）接下來一些比較常規(guī)的操作，就大概說一下。

• （3）配膠：取一套玻璃板（我的板子都是做完洗的，每次都是直接用的），用洗潔精清洗干凈后，用去離子水沖洗干凈。分離膠和濃縮膠的配方附在后面，看自己需要多大分子量，按需配置就可。

• （4）灌膠：1ml加樣槍灌分離膠，距頂端0.5cm處用無水乙醇液封，常溫置30min；倒去無水乙醇，用去離子水沖洗一下，用濾紙吸干殘留水分，灌濃縮膠，立即插入梳子，靜置30min。

• （5）上樣：每孔保持同樣質(zhì)量同樣體積的樣品，在一孔中加入marker，避免浪費，一般加3-4ul的marker就夠了。

• （6）電泳（SDS-PAGE）：電泳分離蛋白，通常條件濃縮膠為恒壓70V，電泳到濃縮膠和分離膠分界處就可以換電壓，換成120V直至溴酚藍(lán)到達(dá)底部為止。

• （7）轉(zhuǎn)膜：PVDF膜在甲醇中泡5min，制備“三明治”，從上到下依次為濾紙-PVDF膜-膠-濾紙，切取膠塊，然后按順序裝膜，放于電泳槽中（紅對紅、黑對黑），在4℃冷庫中，恒流180mA，電轉(zhuǎn)120min。

• （8）封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，5%的脫脂奶粉室溫封閉1小時。

• （9）孵育一抗：封閉結(jié)束后，用1TBST洗膜35min；孵育一抗，4℃冷庫內(nèi)搖床過夜，以使抗原抗體充分結(jié)合。

• （10）孵育二抗及顯影：將于4℃過夜的膜取出，用1TBST洗膜35min，孵育二抗，室溫1小時；1TBST洗膜35min；ECL顯影液，A:B=1:1；發(fā)光。

• （11）數(shù)據(jù)分析：應(yīng)用Bio-Rad Quantity One software軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計，目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參Actin的灰度值以校正上樣誤差。

我知道大家可能都知道怎么做，但是我還是來啰嗦一下必要的這幾個東西的原理，只說關(guān)鍵點。這樣更有利于自己來做和變通。Western的原理我就不講了。

幾個關(guān)鍵點

• 30%丙烯酰胺：避光，4℃保存，pH不能超過7，因為光和堿會使其發(fā)生脫氨基反應(yīng)。

• APS和TEMED作用：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺聚合形成的高分子。這個聚合反應(yīng)是自由基聚合，而自由基的聚合需要引發(fā)劑，APS就是引發(fā)劑，TEMED則可以催化APS產(chǎn)生自由基，從而加速丙烯酰胺聚合。APS一定要新鮮最好分裝后保存在-20度，超過2周的APS最好扔掉，或者已經(jīng)反復(fù)打開使用多次的APS都別用。

• SDS：可以為電泳提供鈉離子，與蛋白質(zhì)相互作用，使蛋白質(zhì)變性，形成負(fù)電荷SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，去除蛋白的電荷，解離蛋白之間的氫鍵，同時還能去除蛋白的疏水作用，使得蛋白分離僅受蛋白質(zhì)分子量的大小影響。

• 甲醇：能使SDS與蛋白分離，甲醇濃度越高SDS與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對蛋白有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來。大蛋白轉(zhuǎn)印降低甲醇濃度，另外SDS須添加；而小蛋白則需增加甲醇濃度。甲醇的另一個作用是降溫，舊的電轉(zhuǎn)液由于電解質(zhì)的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉(zhuǎn)時電流或電壓變化更快、溫度升高也更快，電轉(zhuǎn)液最多用三次。

• 分離膠壓膠：可用過無水乙醇，異丙醇，雙蒸水，正丁醇等，封閉分離膠,是為了讓膠更快的凝固，防止氧化同時還可以起到壓膠平行的作用。水或醇，二者均可，如果壓不平，那絕對不是溶液的問題，而是手法的問題。至于區(qū)別，水會稀釋界面，醇會從界面吸水。并不存在一般人所說的誰壓的更平的說法。而是影響的sds和ph及界面的膠濃度，當(dāng)然影響都是非常小的，一般都是可以忽略的。這就是為什么用什么封的人都有。但如果非要嚴(yán)格要求的話，低濃度的用水封，高濃度的用醇封。不管大小分子，我都是用醇封的，并沒有太大的影響。

• PVDF膜：0.45um 用于一般蛋白；0.2um用于分子量小于20kD蛋白。

• 操作所有試劑均需戴手套，口罩，基本所有試劑均有神經(jīng)毒性，同時還可以防止污染樣品。

• 通常我們在做濕轉(zhuǎn)的時候，選擇100V恒壓（高強度，因為低強度時間較長，且效率較低），電流控制在120-350mA之間，分子量在60KD以下的60分鐘即可，分子量在60KD以上的需要延長轉(zhuǎn)膜時間60-150分鐘才能確保高效率的轉(zhuǎn)膜。電轉(zhuǎn)液一般可以重復(fù)使用3次，之后電流會過大，不適合再使用。

• 而對于半干轉(zhuǎn)，一般選擇恒流（膜面積的3倍：3 mA/cm²） 之間一般60分鐘，同樣根據(jù)蛋白分子量適當(dāng)調(diào)節(jié)時間。

• 濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。

• 濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。

• 因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。

• 濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。

遇到的問題:

gel通常在0.5-1h內(nèi)凝集最好，過快表示TEMED、APS用量過多，此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實際不純或?qū)嵭А?/p>

• ︶ 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。

• ︵ 條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

• 拖尾：樣品溶解不好。

• 紋理（縱向條紋）：樣品中含有不溶性顆粒。

• 條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

• 條帶兩邊擴散：加樣量過多。

抗體很關(guān)鍵，抗體好，就可以做到事半功倍，即使其他做的差點，結(jié)果也是勉強可以看，若是抗體不好，那就需要考驗技術(shù)了。一定要選擇好用的抗體，會讓你有飛一般的感覺。

分離膠濃度與最佳分離范圍：

以上是分離膠濃度選擇和分離范圍，但是在選擇時，一般大于27kd，選擇10%的膠，大于15kd選12%的膠，大于10kd，選15%的膠。轉(zhuǎn)膜條件不管時多大的分子（10kd-180kd），都可以用105v,105min。關(guān)于選擇恒壓還是恒流我也是糾結(jié)了很久。

要搞清楚這點就需要弄明白轉(zhuǎn)膜效率是和電流有關(guān)還是和電壓有關(guān)，還是和二者都有關(guān)？

關(guān)于恒流和恒壓的關(guān)系及轉(zhuǎn)移效率取決于什么：

想要搞清楚恒流和恒壓的關(guān)系及效率，首先肯定要明確的是電阻的變化，我們只要了解到電阻的變化，恒壓或者恒流后的變化就會相對好理解。濕轉(zhuǎn)法的兩電極板加膠/膜疊層浸入緩沖液槽中，整個緩沖體系形成一個電阻，由于剛開始時緩沖液可維持相對恒定的ph值，所以此時的電阻應(yīng)該是相對恒定的。隨著轉(zhuǎn)膜的進(jìn)行，產(chǎn)生的熱量會增加，電阻也增大。（轉(zhuǎn)膜的時候一般都會加冰塊，降溫，或者是放到冷庫，使整個體系保持在相對低溫的狀態(tài)，只要電流不是特別大，電阻增大的應(yīng)該不會特別多）。接下來看恒流或者恒壓的影響。

轉(zhuǎn)膜就是要讓凝膠中帶負(fù)電荷的蛋白在電場的作用下向正極遷移，當(dāng)正好遷移到膜上的位置時停止；我們知道電流是電壓的定向移動形成的，所以個人覺的轉(zhuǎn)移速度的大小主要取決于電流的大??；恒流轉(zhuǎn)移時，轉(zhuǎn)移速度是恒定的，隨著電阻的增加，電壓也會增加，隨著時間推移，產(chǎn)熱增加。這樣的優(yōu)點是轉(zhuǎn)膜效率較高，比較平穩(wěn)，但是產(chǎn)熱量較大，高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形；

恒壓轉(zhuǎn)移時，由于電阻是逐漸增大的，所以電流是開始到最大，以后逐漸降低，即轉(zhuǎn)移效率開始最高，以后逐漸降低，優(yōu)點是產(chǎn)熱較少，但轉(zhuǎn)移效率受影響；

為什么自己會選擇恒壓，是因為用恒流時，發(fā)現(xiàn)電轉(zhuǎn)完整個槽子的溫度有很明顯的升高，雖然好像對結(jié)果看起來沒有很大的影響，但是當(dāng)用成恒壓后電轉(zhuǎn)完成，整個槽子的溫度并沒有明顯的變化，同時結(jié)果也比較穩(wěn)定，雖然確實存在效率要低些，但是180kd以下都是沒有問題的，而且伯樂的Trans－blot semi dry transfering cell操作手冊上提供的是恒壓的方案。
配好膠，抗體棒，剩下最最重要的一點就是黑對黑，紅對紅。。。你懂的。。。