1 年度關(guān)鍵詞 6月底在“Top 10 Emerging Technologies 2017”上公布的全球十大新興技術(shù)中最直接與醫(yī)療相關(guān)的就是——液體活檢（liquid biopsies），盡管2017年才過去一半，資本市場在腫瘤液體活檢市場的投入已超過13億美元，十足“火熱”。 常規(guī)檢測：組織 有創(chuàng)、獲取困難異質(zhì)性 液體活檢：外周血 無創(chuàng)、易于獲取綜合評估 *來源 My Cancer Genome 如上圖所示，與傳統(tǒng)的組織活檢相比，穿刺針取組織與采血管采血，不管是從耗時耗材、人員要求、患者身體狀態(tài)以及感染擴散等因素，更進一步涉及到腫瘤異質(zhì)性，液體活檢的先天優(yōu)勢顯著。 2 血液的秘密 *全血和血漿內(nèi)各組分的組成 雖然唾液、尿液等體液中也存在游離DNA，可作為檢測來源，但目前最適用于臨床的還是血液。1mL血約能提取出15ng游離DNA，相當(dāng)于來自約2000個細胞的DNA量，所以，血液中ctDNA的量是極少的。上圖顯示了血液的不同組成成分，并大致地對其做了定量，液體活檢專注的是血液中來自腫瘤的細胞、DNA以及其他腫瘤標(biāo)志物，主要集中于血漿，但因為含量極少，而且容易和血漿蛋白相結(jié)合，因而常規(guī)的提取效率都不高，目前商品化的試劑盒絕大多數(shù)都是基于微柱吸附法和磁珠吸附法，如MagNA Pure isolation system（Roche Diagnostics）和QIAamp DNA Blood Midi Kit（QIAgen），富集技術(shù)的逐步發(fā)展正推進著檢測的精準(zhǔn)性 腫瘤相關(guān)的標(biāo)志物，特別是釋放到血液里的標(biāo)志物，在腫瘤不同的階段有不同的特征，代表腫瘤發(fā)展的狀況。所以在腫瘤的不同階段，液體活檢會有不同的意義和它存在的價值。 3 液體活檢“三足鼎立” 液體活檢是個大而化之的名詞，其內(nèi)在包含著多個研究方向，若論現(xiàn)在討論得比較多的標(biāo)志物就是循環(huán)腫瘤細胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）以及外泌體（Exosome），當(dāng)然，隨著研究的深入，這“三個大鼎”后繼還是有料的。 在這之中的循環(huán)腫DNA（ctDNA）是由腫瘤細胞釋放到血液循環(huán)系統(tǒng)里面的DNA，它主要是來源于壞死、凋亡的腫瘤細胞以及外泌體破裂之后釋放的DNA。ctDNA和另外兩者比，是直接在分子層面的，最直觀也最易分析，高通量測序的發(fā)展，使全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）得到數(shù)據(jù)支持，進而提供基因檢測指導(dǎo)靶向藥物的臨床意義，因此給了比CTC晚發(fā)現(xiàn)的ctDNA“彎道超車”的機會。 *ctDNA的來源 4 CtDNA的黃金時代 基于ctDNA檢測的液體活檢在2015年就拿到突破性技術(shù)大獎，勢頭猛烈。PET/CT技術(shù)能發(fā)現(xiàn)直徑大于5mm的腫瘤組織，但2mm是腫瘤生長的關(guān)鍵時期，因此基于分子層面的基因檢測是未來腫瘤早篩的必然趨勢。關(guān)于ctDNA檢測，可以深入淺出地逐步探討一下。 *來源網(wǎng)絡(luò) 1 研發(fā)歷程 早在1948年，研究發(fā)現(xiàn)細胞核內(nèi)的DNA并非一直躲在核內(nèi)，也有游離在外的，所有游離在血液中的DNA統(tǒng)稱為cfDNA(cell-free DNA)，而來自腫瘤細胞的cfDNA就是ctDNA。1977年，有研究證明，腫瘤患者血漿游離DNA含量高于健康人群。到了1994年，科學(xué)家通過識別ctDNA身上攜帶的腫瘤特異性的基因突變（KRAS突變），首次區(qū)分出來源于腫瘤的游離DNA。 2 基本特征 ■ 含量低、濃度低 根據(jù)已有研究，ctDNA 在 cfDNA 中的占比在0.01%～1%，受到癌種、時期等因素的影響。晚期癌癥患者的血漿中 ctDNA 的含量較高，研究也相對較多，而 ctDNA 在早期癌癥中的研究則受限于 ctDNA 的含量。實際上，ctNDA研究是在近十年才有了突破性的發(fā)展，但隨著多種測序技術(shù)的升級，ctDNA檢測的靈敏度和特異性都得到了大幅度提高。 ■ 突變頻率低 液體活檢大咖企業(yè)Guradant health做過一個大樣本研究，發(fā)現(xiàn)游離DNA里面腫瘤相關(guān)突變的等位基因頻率（variant allele frequency，VAF），也就是突變頻率是非常低的，證明ctDNA大部分的突變都是低頻率的。 *1000例癌癥患者cfDNA中的單核苷酸突變 3 檢測方法 *ctDNA的檢測方法對比 對于已知突變，一般有基于PCR的方法，如ARMS-PCR，基于數(shù)字PCR，如BEAMing和ddPCR。而對于高通量平臺，如TAM-seq和CAPP-Seq是檢測已知突變的，但全外子組甚至全基因組測序等則可以檢測未知突變，加入單分子標(biāo)記后，大大提高了有效測序深度，檢測下限能達到十萬分之四，對于“三低”的ctDNA來說，高通量測序平臺猶如打開它黃金時代之門的鑰匙。 去年國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心對全國腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測室間質(zhì)量進行了評價，目前應(yīng)用最廣泛的技術(shù)是ARMS-PCR、數(shù)字PCR與NGS平臺。其中ARMS方法具有操作簡單、成本低廉的優(yōu)勢，但假陽性假陰性都不可避免，穩(wěn)定性較差，數(shù)字PCR檢測游離DNA相對最穩(wěn)定，而且易于掌握、準(zhǔn)確度高，特別適合ctDNA檢測及臨床推廣。NGS平臺則可同時檢測多個基因的多種不同變異形式，對于ctDNA的科研有極其重要的作用，并且也適用于目前臨床的訴求，但也從質(zhì)檢結(jié)果體現(xiàn)出NGS實驗室是目前管理最為良莠不齊的，因此要普及NGS檢測ctDNA技術(shù)需要對實驗操作流程與數(shù)據(jù)處理以及標(biāo)準(zhǔn)化提出更高的要求，今年下半年我們也可以期待一下新的質(zhì)檢報告。 4 應(yīng)用方向 *ctDNA的潛在應(yīng)用 CtDNA的應(yīng)用已經(jīng)覆蓋人體絕大多數(shù)的實體瘤，在此總結(jié)一下目前熱門的兩個應(yīng)用。 ■ 腫瘤早期診斷 在含量上，腫瘤患者與健康人群有明顯差異，一般來說腫瘤患者要高很多，但是也不可避免有個體差異，但個體差異的造成也可能是提取技術(shù)的不成熟。而且轉(zhuǎn)移后的腫瘤，腫瘤突變負(fù)荷高，分期越晚，腫瘤突變率也越高，這對于ctDNA檢測都是有益的。加之TP53作為人體內(nèi)重要的抑癌基因，許多團隊希望通過它的檢測來預(yù)測腫瘤發(fā)病風(fēng)險，現(xiàn)在也有通過ctDNA來篩查TP53突變的，相互輔助或許可以使TP53更有力地成為風(fēng)險預(yù)測的靶標(biāo)。 ■ 耐藥評估 這一應(yīng)用可以說是目前ctDNA最熱門的研究方向，可跟蹤獲得性耐藥突變，來進行個體化用藥指導(dǎo)。因為耐藥追蹤需要多次取樣，對于無創(chuàng)的液體活檢技術(shù)而言優(yōu)勢比較大，不管是術(shù)前術(shù)后，不管取樣頻率多高，患者都是可以耐受的，特別針對一些晚期癌癥患者，能及時反映出耐藥突變的發(fā)生，替換靶向藥物的使用，使得治療方案優(yōu)化。 *通過ctDNA監(jiān)測患者體內(nèi)腫瘤驅(qū)動突變 *通過ctDNA監(jiān)測NSCLC患者對奧西替尼的藥物反應(yīng)，組織和血檢具有一致性 當(dāng)然除此之外，在腫瘤發(fā)展監(jiān)控、術(shù)后疾病殘留等方面，ctDNA檢測也在大展拳腳。但也不可避免遇到瓶頸，比如無法準(zhǔn)確預(yù)知腫瘤純度，ctDNA中的低頻突變極易被漏檢，這和組織檢測相比就顯現(xiàn)了劣勢，基礎(chǔ)科學(xué)對于腫瘤發(fā)展機制的深入追究才可解決ctDNA應(yīng)用的局限性，才能完善上述兩個應(yīng)用方向，畢竟早篩早診目前來講還處于科研階段。 5 液體活檢在衡道 上海衡道醫(yī)學(xué)病理診斷中心 提供多種個體化用藥套餐，以基于ctDNA檢測的液體活檢技術(shù)，推出包括非小細胞肺癌8基因/76基因、胃腸癌60基因及多癌種133基因的檢測套餐，滿足臨床多種需求，且具有針對性，協(xié)助醫(yī)生制定最優(yōu)治療方案。 ● 安全無創(chuàng) 參考資料 [1].https://www.mycancergenome.org/content/molecular-medicine/circulating-tumor-dna/ [2].https://en.wikipedia.org/wiki/Circulating_tumor_DNA#ctDNA_in_cancer_screening [3].BrockG, Castellanos-Rizaldos E, Hu L, et al. 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EGFR mutation detection in ctDNA from NSCLCpatient plasma: A cross-platform comparison of leading technologies to supportthe clinical development of AZD9291.[J]. Lung Cancer, 2015, 90(3): 509-515.
對于無法手術(shù)或不耐受穿刺的患者及需要持續(xù)監(jiān)控疾病的患者，僅需15mL外周血，提取循環(huán)腫瘤DNA，1毫升血約能提取15ng游離DNA，相當(dāng)于來自2000個細胞的DNA量。
● 精準(zhǔn)專業(yè)
擁有基因組污染識別專利及自主研發(fā)的單分子標(biāo)記技術(shù)，檢測靈敏度高、特異性強，對目標(biāo)區(qū)域的覆蓋率超過99%，液態(tài)活檢技術(shù)同時可以避免腫瘤組織的異質(zhì)性等問題。且具備完善的數(shù)據(jù)庫資源與優(yōu)秀的臨床專家團隊，可出具科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膱蟾?，并持續(xù)跟進用藥和轉(zhuǎn)歸。
