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基因編輯（gene editing），也叫做基因組編輯（genome editing），是在特異性人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)基礎(chǔ)上針對(duì)目標(biāo)生物基因組實(shí)現(xiàn)對(duì)特定 DNA 序列的刪除、插入或修飾，從而獲得具有特定遺傳信息的生物材料的一種生物技術(shù)手段。包括基因的定點(diǎn)敲除、敲入和點(diǎn)編輯等基因組操作。近年來在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，隨著 CRISPR/Cas9 技術(shù)的興起和普及，利用該編輯工具在基因組目標(biāo)位點(diǎn)引入雙鏈斷裂（Double strand break, DSB ）后進(jìn)行目的基因的改造成為大熱。
1.什么是CRISPR/Cas9?
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats( CRISPR )是常間回文重復(fù)序列叢集，存在于大量的細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，該類基因組中含有曾經(jīng)攻擊過該細(xì)菌的病毒的基因片段，屬于一種獲得性免疫。細(xì)菌利用”記憶“這些病毒基因組片段來偵測(cè)并抵抗相同病毒的攻擊，并摧毀其 DNA 。Cas9 是 CRISPR 基因座相關(guān)的一種蛋白，具有核酸酶活性，負(fù)責(zé)對(duì)靶位點(diǎn)（DNA）切割工作。
附上CRISPR研究領(lǐng)域大神張鋒團(tuán)隊(duì)參與制作的CRISPR工作原理視頻，便于大家直觀了解。
2.CRISPR/Cas9為什么火了并持續(xù)火著？
說到底，CRISPR/Cas9是一種人工核酸酶（artificial nuclease）。人工核酸酶的發(fā)展大致分為四個(gè)時(shí)期：
1）大范圍核酸酶(Meganucleases)是最早被應(yīng)用于基因組靶向修飾研究的核酸酶。 Meganucleases 識(shí)別的 DNA 序列比普通的核酸內(nèi)切酶長(zhǎng)，一般是12~40 bp，這種長(zhǎng)度的 DNA 序列在基因組中一般不會(huì)有脫靶位點(diǎn)，能夠保證 Meganucleases 的特異性。但是針對(duì)特定位點(diǎn)的 Meganucleases 的篩選和改造非常困難，這在很大程度上限制了 Meganucleases 的廣泛應(yīng)用。
2）1996 年第一代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)—鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases， ZFNs)的誕 生為基因組編輯研究領(lǐng)域帶來新的契機(jī)。Kim等人在體外研究中首次將來源于真核生物轉(zhuǎn)錄因子的鋅指蛋白 (Zinc Finger Protein， ZFP)與 FokI 核酸酶的切割域進(jìn)行融合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定 DNA 分子的高效特異性切割。鋅指核酸酶通過鋅指蛋白來特異性的識(shí)別靶序列(分左右兩側(cè))，進(jìn)而引導(dǎo)不具有切割活性的 FokI 切割域單體在特定靶序列上形成具有非特異性切割活性的二聚體，并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的特異性切割。（如下圖）
一個(gè)鋅指核酸酶單體一般需要3 個(gè)或以上的鋅指蛋白模塊來保證對(duì)靶序列識(shí)別的特異性，而一個(gè)鋅指蛋白模塊識(shí)別的是3 個(gè)堿基；這樣略顯繁瑣的識(shí)別方式在保證脫靶率很低的同時(shí)也限制了該核酸酶的改造以及靶位點(diǎn)的選擇。加上隨后出現(xiàn)的二代基因編輯工具（TALEN），鋅指核酸酶漸漸淡出研究者的視線。
3）第二代由FokI介導(dǎo)的特異性人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)—TALE核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs,)。TALENs 通過TALE (Transcription activator-like effector) 蛋白對(duì)靶序列(分左右兩側(cè))的特異性識(shí)別來募集不具有切割活性的FokI切割域單體，進(jìn)而在特定靶序列上形成具有非特異性切割活性的FokI 二聚體，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的特異性識(shí)別和切割。（如下圖）
與鋅指蛋白相比，TALENs 的TALE DNA 結(jié)合域具有更高的特異性，可以通過直接組裝來獲得。但是，TALENs 需要含有12~18 個(gè)TALE 重復(fù)單元以保證其對(duì)靶序列識(shí)別的特異性，而這些TALE 重復(fù)單元是高度同源的；因此，TALE 核酸酶構(gòu)建和改造限制了該技術(shù)的普及和應(yīng)用。
4）現(xiàn)在基因編輯中最常用的是來源于釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes，S. pyogenes）中的II型CRISPR/Cas9，該系統(tǒng)中的crRNA 和tracrRNA 連接起來所形成的導(dǎo)向RNA 分子(single-guide RNA, sgRNA 或gRNA)，能夠介導(dǎo)Cas9 蛋白對(duì)特定DNA 分子的靶向切割。靶位點(diǎn)長(zhǎng)度為20個(gè)堿基，唯一的限定條件是靶序列3’端需要有PAM序列（常見為NGG，N代表任意堿基）。CRISPR/Cas9核酸酶能夠通過一個(gè)很小的RNA分子實(shí)現(xiàn)其對(duì)DNA 靶序列的特異性識(shí)別和切割，改造起來比依賴于ZFP 蛋白的鋅指核酸酶和依賴于TALE 蛋白的TALE 核酸酶具有更大的優(yōu)勢(shì)。自2013年成功用于編輯DNA 起直到如今，都是基因編輯領(lǐng)域中的重要操作工具。
3.CRISPR/Cas9在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用
自張鋒等成功利用此技術(shù)編輯了人類細(xì)胞，CRISPR的適用范圍就一直在擴(kuò)大；比如通過體細(xì)胞編輯技術(shù)來治療一些罕見的基因疾病 (例如：Leber先天性黑朦10型患者LAC10，一種視網(wǎng)膜退行性病變；肌肉疾?。杭俜蚀笮图I(yíng)養(yǎng)不良癥；非惡性血液疾??；肺部疾?。耗夷[纖維化；肝臟疾?。害?1抗胰蛋白酶缺乏癥；癌癥等)，以及農(nóng)業(yè)上一些選育的應(yīng)用。
4. CCR5治療艾滋病不僅僅是敲除它這么簡(jiǎn)單
CCR5，全稱為C-C趨化因子受體5 (C-C Chemokine receptor 5)，目前已在此基因的編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了多種有意義的突變，尤其以對(duì)基因編碼區(qū)突變體CCR5△32的研究最為廣泛。CCR5△32是指CCR5 基因中有32 個(gè)堿基的缺失，使CCR5 蛋白無法正常穿膜表達(dá)于細(xì)胞膜上，進(jìn)而使HIV1 病毒不能進(jìn)入宿主細(xì)胞。CCR5 △32基因型被發(fā)現(xiàn)于歐洲，大約有10%的歐洲人天然攜帶該缺陷型CCR5 基因（CCR5 △32）并且可以抵制艾滋病毒的侵染。故CCR5 基因成為了研究艾滋病治療的首選熱門基因。但是CCR5不僅僅只與艾滋病有關(guān)，該基因與人體其它重要免疫功能也密不可分，比如具有調(diào)控T 細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨嗜細(xì)胞系的遷移、增殖與免疫的功能。
近日就有來自加州大學(xué)洛杉磯分校的神經(jīng)生物學(xué)家Alcino J. Silva發(fā)文章表明敲除CCR5 基因這不僅可以使老鼠更聰明，提升認(rèn)知功能而且還能改善中風(fēng)后的大腦恢復(fù)問題，甚至還與學(xué)生在學(xué)校是否能取得優(yōu)異的成績(jī)有關(guān)。簡(jiǎn)單來說，CCR5 基因突變可能會(huì)影響人的認(rèn)知功能。
不僅如此，CCR5 基因的存在能夠抵御一些嚴(yán)重傳染病。比如，CCR5蛋白能調(diào)動(dòng)關(guān)鍵免疫細(xì)胞對(duì)抗肺部病毒，如果沒有這個(gè)基因，這一防御系統(tǒng)就會(huì)潰敗，從而使CCR5 缺失的個(gè)體死于流感的風(fēng)險(xiǎn)是普通人的4 倍。此外，CCR5 基因公認(rèn)對(duì)西尼羅病毒、蜱傳病毒、登革熱和黃熱病病毒等具有防護(hù)作用。
盡管如此，對(duì)于CCR5 基因的功能以及缺失后產(chǎn)生的代價(jià)我們還沒有完全了解，這也許比我們想象的要復(fù)雜的多，所以對(duì)該基因的編輯還是應(yīng)該慎重再慎重。
CRISPR/Cas9 對(duì)PAM（NGG）序列的高度依賴使得其成為一把“雙刃劍”，一方面，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)理論上可以在任何含有PAM 序列的靶位點(diǎn)處進(jìn)行高效切割；但另一方面，對(duì)PAM 序列的高度依賴又將成為限制其進(jìn)行基因組編輯的障礙。并且現(xiàn)有技術(shù)只能預(yù)估處潛在的脫靶位點(diǎn)，伴隨著一定的脫靶概率，即使檢測(cè)并排除了潛在預(yù)估脫靶位點(diǎn)的不良影響，也無法肯定在龐大的基因組上的其他位置沒有任何損傷。
基因編輯看似只需要一個(gè)核酸酶蛋白以及一個(gè)導(dǎo)向RNA ，操作簡(jiǎn)便，但其潛在的影響我們還無法得出結(jié)論。
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