01 負(fù)值產(chǎn)生的原因 首先我們要知道生化檢驗(yàn)結(jié)果是如何得到的，以CRE為例。 CRE在15、16點(diǎn)吸光度的均值為A1， 在33、34點(diǎn)吸光度的均值為A2，那么CRE的吸光度AX=A2-A1。 然后將Ax代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中就可得到CRE濃度Cx。 計(jì)算公式為：Cx={K*(AX-B)+C1}*IFA+IFB STD（1）：空白液 （第一標(biāo)液） STD（2）：標(biāo)準(zhǔn)液 （第二標(biāo)液） K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；FA+IFB為儀器常數(shù)；C1一般為0。因此濃度計(jì)算公式可以簡化為：Cx=K*(AX-B)； 然后由公式及AX=A2-A1就可以得出負(fù)值的原因：AX-B＜0或A2-A1＜0。 當(dāng)AX-B＜0表示檢測項(xiàng)目的吸光度小于空白吸光度；一般為檢測系統(tǒng)出現(xiàn)問題導(dǎo)致杯空白過高。 當(dāng)Ax＜0表示試劑原因或標(biāo)本原因，導(dǎo)致反應(yīng)向相反方向進(jìn)行。 02 出現(xiàn)負(fù)值怎么辦？ 經(jīng)過上面的分析我可看出，導(dǎo)致負(fù)值的原因有以下3點(diǎn)： 1、標(biāo)本原因：這種情況只導(dǎo)致某一份檢測結(jié)果出現(xiàn)負(fù)值。 2、試劑原因：這種情況導(dǎo)致多份檢測結(jié)果中某一檢測項(xiàng)目出現(xiàn)負(fù)值 3、檢測系統(tǒng)原因：這種情況導(dǎo)致多份檢測結(jié)果中多個檢測項(xiàng)目出現(xiàn)負(fù)值 可以按照以下步驟進(jìn)行處理： 1、查看標(biāo)本是否脂血，如果是嚴(yán)重脂血標(biāo)本試試高速離心后再檢測或讓患者清淡飲食幾天后再抽血檢測。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng) 2、檢查試劑瓶R1/R2有沒有放反。 3、考慮試劑R1/R2添加錯誤，實(shí)際操作中這種情況可能性較大，可將R1/R2整瓶更換之后重新測試看看（反應(yīng)曲線會有所表現(xiàn)，如果不會看的話直接換掉試試，注意是連瓶子一起換掉?。?。 4、如果是酶類項(xiàng)目或者速率法的項(xiàng)目出現(xiàn)負(fù)值或異常偏低的情況，考慮底物耗盡，可稀釋重測（反應(yīng)曲線也可以看得出來）。 5、試劑連帶瓶子一起換掉，重新定標(biāo)、做試劑空白，做質(zhì)控再測標(biāo)本（一般來講，可解決相當(dāng)大的一部分結(jié)果問題，也比較容易操作）。 6、特別說下總膽紅素和直接膽紅素，這兩個可能是負(fù)值出現(xiàn)頻率較高的項(xiàng)目，因?yàn)樗麄兎磻?yīng)的吸光度變化比較小，一般也就幾百的吸光度變化。 除了要注意樣本、定標(biāo)品、質(zhì)控品的避光以及試劑空白之外，建議定標(biāo)的時候增加一個0濃度，也就是采用兩點(diǎn)定標(biāo)，一般采用的是單點(diǎn)定標(biāo)，默認(rèn)0濃度的時候吸光度為0通過原點(diǎn)，但有時候其實(shí)不是的，對膽紅素這種反應(yīng)度比較低的項(xiàng)目還是有影響的。 部分生化分析儀的原裝膽紅素試劑，結(jié)果應(yīng)該會比較好一些，專門設(shè)置了通道測定樣本的吸光度，反應(yīng)的吸光度會減掉樣本的吸光度再進(jìn)行計(jì)算。 7、與儀器或試劑的廠家工程師聯(lián)系，尋求幫助。 03 影響生化檢驗(yàn)結(jié)果的主要因素 1、燈泡老化或質(zhì)量問題： 部分生化分析儀是要求吸光度>19000或750小時需要更換。 2、反應(yīng)杯臟或者損壞： 部分生化分析儀是要求與1號反應(yīng)杯的吸光度差值＜±800。 3、清洗針堵塞或者漏氣： 反應(yīng)液無法抽走或者無法添加清洗液進(jìn)行清洗；也有的可能會在測試中滴水，反應(yīng)液被稀釋，造成吸光度突然下降，可能出現(xiàn)負(fù)值。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng) 4、攪拌棒清洗不干凈： 攪拌棒有一層特氟龍涂層，如果被刮壞，不易洗干凈，易造成交叉污染。 5、樣品針堵塞： 樣品沒有被加入到反應(yīng)杯，沒有發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)曲線是一條直線，吸光度沒有變化，差值為負(fù)，出現(xiàn)負(fù)值。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng) 6、試劑R1/R2添加錯誤： 很多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該都是習(xí)慣于在試劑快用完了時，往試劑瓶里面添加試劑的做法，部分生化分析儀加樣順序是：樣本S+試劑R1+試劑R2，因?yàn)橹饕磻?yīng)物在R2，如果放反了，樣本S和試劑R2直接就開始反應(yīng)，吸光度上升，等試劑R1加入后吸光度下降，吸光度差值為負(fù)，結(jié)果出現(xiàn)負(fù)值。 7、嚴(yán)重脂血或黃疸標(biāo)本： 加入樣品S+R1時吸光度就很高，加入R2之后反應(yīng)的吸光度可能還沒有S+R1高，吸光度差值為負(fù)，結(jié)果出現(xiàn)負(fù)值。 8、長時間未定標(biāo)或未做試劑空白： 試劑使用時間太長被污染或變質(zhì)，試劑空白吸光度升高很多，等到你下次更換一瓶新試劑的時候，未定標(biāo)或未做試劑空白，使用的還是被污染之后的定標(biāo)和試劑空白結(jié)果，可能出現(xiàn)負(fù)值（見過超過一年沒有定標(biāo)，沒有做試劑空白的）。檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng) 9、底物耗盡： 通俗的講就是，濃度太高，試劑里面的反應(yīng)物不夠用了，造成吸光度異常下降或上升。一般酶類項(xiàng)目會出現(xiàn)這樣的情況，可采取稀釋重做。 04 實(shí)戰(zhàn)案例分析 進(jìn)一步分析，查看AU5831檢測結(jié)果為負(fù)值的標(biāo)本，調(diào)取反應(yīng)曲線，如圖1，圖2，正常反應(yīng)曲線如圖3。 LP（a）檢測方法為兩點(diǎn)終點(diǎn)法，反應(yīng)監(jiān)測12,27兩點(diǎn)吸光度，與正常反應(yīng)曲線對照，可見結(jié)果異常的曲線中，加入試劑2（R2）后吸光度出現(xiàn)不穩(wěn)定的變化，可出現(xiàn)1-2個小峰，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡，27點(diǎn)的吸光度值若小于12點(diǎn)吸光度值，則檢測結(jié)果可出現(xiàn)負(fù)值，由此考慮反應(yīng)體系中是否存在干擾因素。 如我們此前案例報道的，因日常工作中常需檢測腎內(nèi)血透患者標(biāo)本，此類血液標(biāo)本離體后的凝集過程較緩慢，需幾十分鐘甚至更長的時間，常表現(xiàn)為反復(fù)離心反復(fù)血清凝集的現(xiàn)象，故檢測過程中較易產(chǎn)生凝塊，長期積累有時可粘附杯壁，較難清洗，且易堵塞清洗比色系統(tǒng)的抽取廢液的探針或管路。另一方面，生化管中存在分離膠，離心不當(dāng)有時可造成溶膠，凝膠亦可粘附杯壁及造成抽取廢液的探針或管路堵塞。遂首先觀察比色杯是否異常，查看檢測結(jié)果為負(fù)值的LP（a）所使用的比色杯，比較同一比色杯檢測的不同項(xiàng)目是否出現(xiàn)相同的曲線異常，如圖4，圖5，圖6。 如上圖，通過比較可見，同樣使用201號比色杯，LP（a）曲線異常，而ALP和CHO曲線正常，其他比色杯亦只有LP（a）檢測異常，由此可排除比色杯因素造成檢測結(jié)果為負(fù)值。 既然不是比色杯異常影響比色，則進(jìn)一步分析考慮是否為光源不穩(wěn)定產(chǎn)生干擾。LP（a）檢測為單波長，所用波長為600nm，故重點(diǎn)觀察600nm附近檢測波長的項(xiàng)目，通過比較可知，TG（如圖5），主波長為660nm，CHO（如圖6），主波長為540nm，兩者反應(yīng)曲線平滑，且其他波長（如340nm等）處的檢測項(xiàng)目均未見異常，由此排除光源不穩(wěn)定造成的檢測結(jié)果為負(fù)值。 排除以上標(biāo)本及儀器因素的干擾，明確僅有LP（a）一個項(xiàng)目結(jié)果異常后，接下來則考慮試劑因素。從異常的反應(yīng)曲線可見，試劑1加入后曲線無異常，而加入R2后，吸光度出現(xiàn)不穩(wěn)定變化，故推測干擾來自R2試劑，疑R2試劑被污染，于是將R2試劑全部更換，隨后進(jìn)行校準(zhǔn)，質(zhì)控，室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果在控，反應(yīng)曲線如圖7。
更換試劑后，將檢測結(jié)果異常的標(biāo)本重新檢測，反應(yīng)曲線恢復(fù)正常，結(jié)果為正值。
生化檢驗(yàn)中項(xiàng)目的檢測干擾因素眾多，當(dāng)檢測結(jié)果出現(xiàn)異常時，如何對問題進(jìn)行分析處理是每個生化檢驗(yàn)人員應(yīng)具備的能力。反應(yīng)曲線作為生化反應(yīng)過程的直觀反映，當(dāng)遇到問題時，我們可以通過分析曲線，查找檢測過程中誤差、失控產(chǎn)生的原因，從而有針對性地找到解決問題的方法，使儀器盡快恢復(fù)正常工作。
資料來源：基層檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng)、妙畢生化、檢驗(yàn)視界網(wǎng)、臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)
