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每周新知

▲上期回顧

（點(diǎn)擊圖片可看大圖，下同）

腫瘤精準(zhǔn)診療的關(guān)鍵目標(biāo)是改善癌癥的診斷和治療，由于腫瘤組織檢測存在臨床上難以獲取組織（如組織樣本量不足、由于發(fā)生骨轉(zhuǎn)移或者腦轉(zhuǎn)移而很難獲取組織或無法獲取組織樣本等）以及空間/時(shí)間/結(jié)構(gòu)/功能異質(zhì)性等局限性因素，而液體活檢因不具備侵襲性，且可以在疾病治療的不同階段重復(fù)進(jìn)行，使得目前腫瘤精準(zhǔn)診療的焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向液體活檢。

液體活檢的分析物包括（見圖1）：

• 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs，circulating tumour cells）

• 循環(huán)游離DNA（cfDNA，circulating cell- free DNA）

• 細(xì)胞外囊泡（EVs，extracellular vesicles）

• 循環(huán)游離RNA（cfRNA，circulating cell- free RNA）

• 蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物

▲圖1 液體活檢的分析物

以高通量捕獲測序?yàn)榛A(chǔ)的ctDNA檢測可以實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、全面的揭示全身多病灶突變信息。

研究表明，ctDNA可能來自凋亡細(xì)胞，因此其可能代表腫瘤細(xì)胞的特定亞型。但也有研究認(rèn)為，ctDNA提供了腫瘤基因組的全景視圖，因?yàn)樗从沉藦亩鄠€(gè)腫瘤區(qū)域或不同腫瘤病灶釋放的DNA信息，對(duì)ctDNA的分析可以發(fā)現(xiàn)組織活檢中無法發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，如今的深度測序已經(jīng)能夠滿足評(píng)估腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和亞克隆突變的需求，并且能夠揭示具有不同基因組特征的特定分子亞型。事實(shí)上ctDNA檢測分析可以實(shí)現(xiàn)腫瘤患者的全程診療管理（見圖2）。

▲圖2 ctDNA檢測可實(shí)現(xiàn)腫瘤患者的全程管理

ctDNA因具有以下優(yōu)點(diǎn)而能夠成為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)的潛力標(biāo)志物：

• 提供對(duì)腫瘤基因組的綜合描述；

• 深度測序可以發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和只在部分細(xì)胞中出現(xiàn)的基因突變；

• 與CTC相比，ctDNA作為生物標(biāo)志物的優(yōu)勢在于它可能提供有關(guān)腫瘤大小的信息，從而反映出疾病的發(fā)展?fàn)顟B(tài)和對(duì)療法的反應(yīng)；

• 具備預(yù)測預(yù)后的價(jià)值；

• 能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤抗性；

• 提供對(duì)腫瘤基因組的綜合描述等。
  

▲圖3 ctDNA作為精準(zhǔn)腫瘤學(xué)生物標(biāo)志物的潛力

然而，ctDNA在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中的應(yīng)用中也面臨很多困境和挑戰(zhàn)。

目前公布的ctDNA檢測數(shù)據(jù)主要集中在主流癌種，如肺癌和結(jié)直腸癌，而針對(duì)發(fā)病率偏低的癌癥類型其研究相對(duì)較少。另，作為檢測金標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤組織，臨床上也面臨著ctDNA與組織一致性的比較，它們有各自的特點(diǎn)（見表1）。

表1 組織活檢與ctDNA檢測特點(diǎn)對(duì)比

*：解卷積（Deconvolution），是指從異構(gòu)樣本中提取細(xì)胞類型特異性信息的過程。 在液體活活檢中，這可能涉及將血漿DNA片段分解成其構(gòu)成要素（例如，基于甲基化標(biāo)志物確定其組織起源）。

2016年發(fā)表在Sci Rep.的一篇研究，采集了30例Ⅰ~Ⅱ期和11例Ⅲ~Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌患者的術(shù)前0~13天（平均3.9天）外周血、手術(shù)組織和術(shù)后2~10天（平均5.1天）外周血樣本，使用CA50 panel（包含了50個(gè)與腫瘤用藥、致癌基因通路及腫瘤檢測相關(guān)基因的2856個(gè)熱點(diǎn)突變，通過Ion Torrent Proton檢測平臺(tái)、深度測序（>10,000x），對(duì)血漿ctDNA和組織tDNA突變情況進(jìn)行了比較。

研究顯示，檢測到30例早期（Ⅰ-Ⅱ期）非小細(xì)胞肺癌患者血漿ctDNA的常見驅(qū)動(dòng)突變，并且與組織tDNA高度一致，其中，一致性為80.0%，敏感性為75%，特異性90%，陽性預(yù)測值93.8%（見圖4）。

▲圖4 早期血漿ctDNA與組織tDNA一致性分析

ctDNA 的檢測另難點(diǎn)之一是：血液中的ctDNA通常在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于非癌cfDNA，因此分析ctDNA時(shí)的瓶頸問題在于如何從正常細(xì)胞cfDNA背景下檢測到罕見的ctDNA片段。

ctDNA具有高度碎片化的特點(diǎn)，在血液中是以裸露核酸的形式存在，這也從另一個(gè)側(cè)面提示它們可能源于凋亡進(jìn)程中核小體所含的核酸片段。

研究表明，cfDNA的半衰期僅有1~2個(gè)小時(shí)，在外周血中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的不斷變化的過程，其表達(dá)量取決于產(chǎn)生cfDNA的來源。血漿中總cfDNA含量低，且ctDNA僅為cfDNA中很小的一部分，雖然ctDNA在cfDNA中的占比波動(dòng)范圍非常大，但實(shí)際上大多數(shù)ctDNA在cfDNA中的占比~0.2%。

在檢測中一般是通過進(jìn)一步提高分析靈敏度來解決上述問題。臨床實(shí)踐中的解決方法之一是通過顯著增加樣本體積（即采集腫瘤患者更多的血液）來增加可檢測分子的數(shù)量，但這種方法在晚期疾病患者中通常不具有臨床可行性；或者通過大量血漿樣本突變檢測來確定被定義為腫瘤突變陽性所需的最小檢測突變數(shù)，從而彌補(bǔ)ctDNA的低起始量。

解決ctDNA低起始量的最新技術(shù)發(fā)展集中于提高測序方法的分析靈敏度上，但這可能受到血漿cfDNA提取、測序文庫制備、測序過程中引入錯(cuò)誤等影響。例如：在對(duì)特定的基因組區(qū)域進(jìn)行文庫捕獲和富集過程中可能引起DNA的氧化損傷從而導(dǎo)致序列的改變；測序靈敏度受到測序精度和所選用方法的覆蓋率影響等。通常使用UMIs (unique molecular identifiers/barcodes)可以減輕這些因素帶來的問題。靶向錯(cuò)誤校正測序（TEC-Seq，Targeted Error Correction Sequencing）是一種基于UMI的測序方法，可檢測結(jié)直腸癌，肺癌，卵巢癌和乳腺癌患者血漿ctDNA中的常見突變基因，其中，超過75％的患者可以檢測到至少1個(gè)突變。

其他增加分析靈敏度的嘗試集中在基于ctDNA/cfDNA的長度來富集ctDNA片段。

近年來許多研究表明，ctDNA和cfDNA的片段長短存在差異，有研究報(bào)道它們比來自正常細(xì)胞的cfDNA（~166bp）更短，為（132~145bp）。

最近的一項(xiàng)研究報(bào)道是將血漿cfDNA進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后切除膠上適當(dāng)大小的DNA條帶，通過DNA凝膠回收操作以富集ctDNA。然而，靶向單鏈cfDNA（通常比雙鏈DNA短）不會(huì)導(dǎo)致腫瘤DNA片段的富集。 

此外，有研究報(bào)道，在結(jié)直腸癌和乳腺癌高ctDNA水平的患者中，長度>320bp的二聚核小體（dinucleosomal）DNA片段頻率增加。

最近的一項(xiàng)研究表明，DNA片段長度可能因核小體在原始組織中的可及性而產(chǎn)生差異。如，相較于胎盤細(xì)胞，白細(xì)胞將核小體核心中的不同位置暴露于核酸酶活性，因此胎盤細(xì)胞顯示出比白細(xì)胞更高的核小體可及性，這可能解釋了為什么懷孕女性血漿中的胎兒DNA比其cfDNA片段更短。

如果在癌細(xì)胞中運(yùn)行類似的機(jī)制，對(duì)DNA片段長度的測量有可能區(qū)分血漿中各種細(xì)胞來源的DNA。當(dāng)然需要更多的研究工作來進(jìn)一步確定是否可以基于這種可能的片段大小差異來選擇特定的cfDNA亞群。

以上內(nèi)容根據(jù)筆者自己的理解進(jìn)行整理，若有疏漏異議，歡迎大家留言指正

主要參考文獻(xiàn)：

(1) Heitzer E. et al．Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.Nat Rev Genet (2018).

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(3) Guo N. et al.Circulating tumor DNA detection in lung cancer patients before and after surgery.Sci Rep. 19;6:33519 (2016).

(4) Heidary, M. et al. The dynamic range of circulating tumor DNA in metastatic breast cancer. Breast Cancer .Res. 16, 421 (2014).

(5) Heitzer, E. et al. Establishment of tumor- specific copy number alterations from plasma DNA of patients with cancer. Int. J. Cancer 133, 346–356 (2013).

(6) Phallen, J. et al. Direct detection of early- stage cancers using circulating tumor DNA. Sci. Transl Med. 9, eaan2415 (2017).

(7) Sun, K. et al. Size- tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing.  Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, E5106–E5114  (2018) .

每周討論

討論：目前單細(xì)胞測序技術(shù)還在發(fā)展階段，因?yàn)槠渖婕暗絅GS技術(shù)，有哪些技術(shù)問題是仍需要解決的呢？

(1) 目標(biāo)細(xì)胞的提取問題：要能夠準(zhǔn)確篩選目標(biāo)細(xì)胞，如正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞不被周圍細(xì)胞污染；

(2) 擴(kuò)增失敗和等位基因脫扣；

(3) PCR產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物問題；

(4) NCS的重復(fù)性問題；

(5) 如何降低測序成本問題等。

討論：

(1) 傳統(tǒng)的cfDNA片段大小研究方法是怎樣的？

(2) cfDNA片段長度及分布有何規(guī)律？