文章的主要?jiǎng)?chuàng)新在于研究方法、統(tǒng)計(jì)分析手段和思路。且研究工作全面，建立ctDNA片段特征圖譜，無(wú)需先對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，便可幫助確定血漿中ctDNA的存在與含量。且在全基因組和泛癌范圍內(nèi)鑒定了突變和非突變DNA的大小差異。
利用cfDNA片段特征分析可以增加ctDNA檢測(cè)評(píng)估敏感性。
得出大多癌癥類(lèi)型的ctDNA的小于167bp，部分大于167bp，主要集中在250~320bp間的研究結(jié)論。關(guān)于大于167bp部分ctDNA來(lái)源尚不清楚，提高對(duì)其認(rèn)知具有重要意義。
篩選血漿樣本中DNA片段能夠富集樣本中ctDNA含量，檢出更多突變類(lèi)型。
ctDNA是來(lái)自腫瘤基因組的碎片，其在癌癥診療中的作用不言而喻?，F(xiàn)有的檢測(cè)ctDNA的方法主要關(guān)注于基因組的改變，但很少考慮血漿cfDNA的生物學(xué)特性。
目前提高ctDNA敏感性方法主要是通過(guò)提高測(cè)序深度，但會(huì)伴隨著錯(cuò)誤變異的檢出。然而，只關(guān)注基因組突變的方法不能利用染色質(zhì)組織或ctDNA片段大小的潛在差異，而且只加深測(cè)序深度很容易檢出許多來(lái)自非癌細(xì)胞的假陽(yáng)性突變。
與血漿中背景DNA片段對(duì)比，ctDNA大多具有片段較短的特征。片段大小分析和特定片段大小的選擇性測(cè)序可以增加ctDNA檢測(cè)敏感性，補(bǔ)充或替代cfDNA的深度測(cè)序方法。
1、腫瘤患者cfDNA片段大小特征研究
作者利用通過(guò)檢測(cè)來(lái)自200名患有18種不同癌癥患者的344份血漿樣本以及來(lái)自健康對(duì)照組的65份血漿樣本，以生成腫瘤cfDNA片段特征圖譜。
圖1 血漿DNA片段特征研究方案
注：通過(guò)對(duì)血漿樣本進(jìn)行雙端測(cè)序可確定cfDNA的片段大小以及反映其在核小體周?chē)慕M織情況。cfDNA通過(guò)各種方式被釋放到血液循環(huán)中，每一種方式都會(huì)在DNA片段的大小差異上留下標(biāo)記。作者通過(guò)sWGS分析推斷cfDNA的大小分布圖譜(n=來(lái)自65名健康對(duì)照組和200名癌癥患者組的344份血漿樣本)，并通過(guò)個(gè)性化捕獲測(cè)序得到突變體ctDNA的大小分布圖譜(n=19份血漿樣本)
圖2 cfDNA片段大小分布
結(jié)果顯示，癌癥患者與健康個(gè)體的cfDNA分別在90~150 bp, 180~220 bp, 250~320 bp區(qū)域的分布均有所差異。健康個(gè)體血漿和晚期膠質(zhì)瘤、腎癌、胰腺癌和膀胱癌患者血漿的cfDNA片段大小明顯長(zhǎng)于晚期乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸和膽管癌患者血漿的cfDNA。作者根據(jù)cfDNA片段在20 ~ 150 bp大小范圍內(nèi)的比例對(duì)18種癌癥類(lèi)型進(jìn)行排序結(jié)果如圖4。
圖3 低于150 bp的cfDNA片段比例
圖4 不同腫瘤類(lèi)型低于150 bp的cfDNA片段比例
2、檢測(cè)突變ctDNA片段大小
作者使用兩種高特異性方法測(cè)定了血漿中突變ctDNA的大小（圖5）。首先，從攜帶人類(lèi)卵巢癌異種移植的小鼠血漿中，通過(guò)sWGS推斷ctDNA和非腫瘤cfDNA的特異性大小圖譜（圖5）。結(jié)果如圖6，ctDNA從小于167bp有一個(gè)變化（增多）。
圖5 突變ctDNA片段大小研究方案
圖6 片大小分布
注：攜帶人類(lèi)卵巢癌異種移植的小鼠血漿中提取DNA的片段大小分布圖譜，紅色表示ctDNA，藍(lán)色表示非腫瘤的cfDNA。兩條垂直虛線(xiàn)指示145和167bp。
其次，測(cè)定19名癌癥患者血漿中突變ctDNA的大小分布，結(jié)果如圖7，攜帶突變等位基因的DNA片段富集在比核糖體DNA短20 ~ 40bp的片段中。突變體的ctDNA主要富集在90~150 bp和250~320bp之間。
圖7 突變DNA和非突變DNA的大小分布
3、體外篩選腫瘤來(lái)源DNA片段
作者利用35例高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的48份血漿樣本中確定了使用臺(tái)式微流控裝置和sWGS在體外選擇大小的短片段選擇性測(cè)序的可行性。結(jié)果顯示在血漿中選擇短的DNA片段可以在全基因組范圍內(nèi)富集腫瘤DNA的含量。
圖8 體外篩選DNA片段結(jié)果
注：綠色指示篩選前片段分布，藍(lán)色指示使用硅膠（in silico）篩選后片段分布，橙色指示in vitro篩選后片段大小分布。
圖9 HGSOC患者樣本體外DNA片段選擇的檢測(cè)結(jié)果
注：A代表治療前在血漿cfDNA中鑒定出SCNAs（ctDNA濃度較高），B代表在化療開(kāi)始3周后采集的血漿樣本中，只觀(guān)察到少量的局灶性SCNAs，以及C代表經(jīng)片段篩選處理富集ctDNA后，能觀(guān)察到未經(jīng)處理B組觀(guān)察不到的SCNAs。
4、量化體外篩DNA片段對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響
圖10 突變等位基因 (MAF)與t-MAD相關(guān)性
如圖10結(jié)果顯示，對(duì)于t-MAD大于檢測(cè)閾值(0.015)或MAF> 0.025的樣本，觀(guān)察到t-MAD與MAF之間存在較高的相關(guān)性(r = 0.80)。t-MAD是用來(lái)衡量片段篩選后，ctDNA的富集程度。
5、體外篩DNA片段對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響
圖12 對(duì)比是否經(jīng)過(guò)體外篩選處理樣本對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響
經(jīng)過(guò)體外篩選片段，t-MAD值提高（圖12A）。經(jīng)過(guò)體外篩選片段處理樣本，腫瘤分子比率提高（圖12B）。經(jīng)過(guò)體外篩選片段處理樣本，能檢出比未經(jīng)過(guò)體外篩選片段處理更多的 SCNAs（圖12C），包括NF1、TERT、MYC等關(guān)鍵腫瘤基因的擴(kuò)增。
圖13 通過(guò)片段大小選擇提高WES對(duì)多種癌癥類(lèi)型體細(xì)胞改變的檢測(cè)
兩種片段篩選方法（in vitro sizeselection，in silico size selection），均能起到富集腫瘤分子作用（圖13A）。與沒(méi)有經(jīng)過(guò)片段篩選處理樣本相比，使用兩種方法（in vitro sizeselection，in silico size selection）篩選片段可以使WES檢測(cè)到的突變數(shù)量平均增加53%，沒(méi)有經(jīng)過(guò)篩選片段處理能檢出10232個(gè)突變，in vitro size selection處理后多檢出260個(gè)突變，in silico size selection處理后多檢出310個(gè)突變（圖13B）。經(jīng)過(guò)in silico size selection處理，幾乎所有突變均得到富集（2133中的2061個(gè)，97%），平均增加1.7倍（圖13C）。經(jīng)過(guò)in silico size selection處理后，16名患者中的13名均檢出額外突變。而在這82個(gè)額外突變中，23(28%)被證實(shí)存在于匹配的腫瘤組織DNA中，其中包括BRAF、ARID1A和NF1等關(guān)鍵癌癥基因的突變（圖13D）。
6、通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)整合片段特征分析和體細(xì)胞突變分析來(lái)檢測(cè)癌信號(hào)
圖14 通過(guò)整合SCNAs和片段大小特征分析以增強(qiáng)ctDNA檢測(cè)敏感度
本研究定義了cfDNA片段大小分布特征，包括：①不同大小范圍內(nèi)片段比例；②不同片段大小的比例；③不同片段大小濃度的振幅范圍（圖14A）。
使用來(lái)自t-MAD評(píng)分和片段特性分析的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行PCA分析，顯示健康樣本和癌癥患者樣本之間的存在分離，結(jié)果還顯示PCA分析與t-MAD評(píng)分結(jié)果具有一致性（圖14B）。
cfDNA片段特征分析增強(qiáng)血漿中腫瘤DNA檢測(cè)的潛力（圖14C-F）。
聯(lián)系客服
