抑郁癥作為一種常見的情感精神障礙疾病，嚴(yán)重危害人類身心健康，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。世界衛(wèi)生組織預(yù)言2020年抑郁癥將會成為第二大臨床慢性疾病[2]。目前，抑郁癥的治療仍以藥物治療為主，多數(shù)化學(xué)抗抑郁藥（如三環(huán)抗抑郁藥、單胺氧化酶抑制劑等）不良反應(yīng)多、起效慢、易復(fù)發(fā)，不能滿足臨床患者需求，而一些中藥或中藥復(fù)方在預(yù)防和治療抑郁癥主癥和兼癥方面表現(xiàn)出良好的效果，不良反應(yīng)較少發(fā)生，逐漸成為研究的重點和熱點[3-4]。
梔子豉湯出自漢代張仲景的《傷寒雜病論》，由梔子和淡豆豉2味藥組成。針對梔子豉湯的抗抑郁作用已有文獻報道。高芳[5]研究結(jié)果表明梔子豉湯能夠使抑郁癥大鼠體質(zhì)量增加，同時對血中多巴胺、5-羥色胺、三酰甘油等物質(zhì)的量起到調(diào)節(jié)作用，證明了梔子豉湯具有一定的抗抑郁作用。蔡絜如[6]對梔子豉湯治療輕度抑郁癥進行了臨床觀察，結(jié)果顯示梔子豉湯治療輕度抑郁癥的總有效率達(dá)94.05%。彭國茳等[7]對梔子中京尼平的抗抑郁機制進行了
靶點、成分-靶點-疾病、成分-靶點-通路等網(wǎng)絡(luò)來闡明藥物的作用機制，非常適合于多成分、多靶點的中藥復(fù)方作用機制的研究[9-10]。
高耀等[11-12]采用PharmMapper方法研究了逍遙散和交泰丸抗抑郁主要活性成分的作用靶點，探討其多成分-多靶點-多通路的作用機制。趙蕾等[13]通過ClueGO插件對百合地黃湯抗抑郁靶點的基因功能及代謝通路進行分析，揭示了百合地黃湯干預(yù)心理亞健康的作用機制。Trindade等[14]采用String、Cytoscape、ClueGO結(jié)合CluePedia等生物信息工具，探討了2種心血管疾病-主動脈瓣狹窄（AVS）和冠狀動脈疾?。?/span>CAD）的病理生理學(xué)和潛在生物標(biāo)志
材料和方法
1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫
TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/, Version 2.3）、PubChem（https://
pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、ChemicalBook（http://www.chemicalbook.com/）、PharmMapper（http://59.78.96.61/pharmmapper/， Update in 2016-12-28）、UniProt數(shù)據(jù)庫中UniProtKB GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/, Version4.5.0）、
Cytoscape軟件（Version 3.4.0）、String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/，
Version 10.5）、Systems dock Web Site（http://systemsdock.unit.oist.jp,
Version 2.0）、ChembiodrawUltra軟件（Version12.0）。
1.2 化學(xué)成分的獲取與活性成分的篩選
通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取梔子豉湯2味藥的化學(xué)成分，再結(jié)合文獻挖掘與整理，依據(jù)化合物在單味藥中的含量、研究熱度和相關(guān)生物學(xué)功能等標(biāo)準(zhǔn)篩選出已報道的梔子豉湯的主要活性成分。
1.3 作用靶點的獲取
所得的活性成分在Chembiodraw Ultra軟件中繪制出各自的結(jié)構(gòu)圖，并以SDFile（*.sdf）格式存儲。并利用PubChem、ChemicalBook和TCMSP平臺對其分子結(jié)構(gòu)進一步確證。登陸PharmMapper服務(wù)器，上傳上述梔子和淡豆豉活性成分的SDFile（*.sdf）格式文件，獲得虛擬篩選結(jié)果。利用UniProt數(shù)據(jù)庫中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白名稱，限定物種為人，限定輸出前300個靶點，將靶點校正為官方名稱（official symbol）。
1.4 抑郁癥相關(guān)靶點的篩選
通過在GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞depression、depressive、depressed和antidepressant搜索已報道的和抑郁癥相關(guān)的基因，去除重復(fù)基因和假陽性基因，與上述PharmMapper服務(wù)器中返回的靶點進行匹配，得到梔子豉湯活性成分的抗抑郁潛在作用靶點。
1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析
將獲得的梔子豉湯的活性成分和作用靶點信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。
將梔子豉湯的作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，利用Multipleproteins工具，限定物種為人，獲取蛋白相互作用，并保存其TSV格式文件。將文件中的node1、node2和combined score信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行分析。在Cytoscape的generate style from statistics工具中將靶點大小和顏色設(shè)置用于反映degree的大小，邊的粗細(xì)設(shè)置用于反映combinescore的大小，從而獲得最終的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。
1.6 分子對接驗證
Systems dock Web Site是一個基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測和分析的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，它應(yīng)用高精度對接模擬和分子通路圖，全面表征配體選擇性，并說明配體如何作用于復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)。它具有DocK-IN評分的分子對接功能，以評估蛋白質(zhì)-配體結(jié)合潛力[16]。用systems dock Web Site對相互作用網(wǎng)絡(luò)中degree值靠前的6個靶點與梔子豉湯的16個成分進行分子對接驗證。
1.7 生物功能和通路分析
結(jié)果
2.1 梔子豉湯活性成分的篩選
TCMSP數(shù)據(jù)庫中分別得到梔子化學(xué)成分98個、淡豆豉化學(xué)成分15個。經(jīng)大量的文獻挖掘與整理，根據(jù)在單味藥中的含量、生物學(xué)功能、研究熱度等篩選出梔子豉湯具有生物活性的成分16個。除了綠原酸、大豆皂苷I、大豆皂苷II、大豆皂苷III和大豆皂苷Ab外，其余成分TCMSP數(shù)據(jù)庫均有收錄。其中梔子活性成分7個，分別為京尼平苷、京尼平、京尼平苷酸、西紅花酸、西紅花苷I、熊果酸和綠原酸。淡豆豉活性成分9個，分別為大豆苷元、染料木苷、染料木黃酮、黃豆黃素、大豆苷、大豆皂苷I、大豆皂苷II、大豆皂苷III和大豆皂苷 Ab。見表1。
2.2 靶點預(yù)測
2.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析
2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
將上述梔子豉湯的43個靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，從而獲得蛋白相互作用關(guān)系（IMPA1、IMPA2、ADH1C未在數(shù)據(jù)庫中找到，還有一些蛋白與其他蛋白沒有相互作用，這些均不在相互作用網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)），導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖2中的節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白間的相互關(guān)聯(lián)，共涉及36個節(jié)點，204條邊。用節(jié)點的大小和顏色表示degree值的大小，節(jié)點越大對應(yīng)的degree值越大，顏色由紅變藍(lán)對應(yīng)的degree值越大。用邊的粗細(xì)表示Combine score值的大小，邊越粗Combine score值越大。
2.5 分子對接
與
2.6 生物功能與通路分析
使用ClueGO結(jié)合CluePedia插件對梔子豉湯活性成分對應(yīng)的43個作用靶點的生物功能和通路進行分析，見圖3。圖3顯示梔子豉湯的作用靶點主要涉及細(xì)胞、組織、器官、代謝、免疫、對應(yīng)激的應(yīng)答等過程，這反映了抑郁癥作為一種復(fù)雜的疾病涉及多種生物過程，梔子豉湯可以通過調(diào)節(jié)這些生物過程來發(fā)揮抗抑郁作用。梔子豉湯作用靶點的通路分析見圖4。圖4顯示梔子豉湯的作用靶點主要涉及瘦素（leptin）、雌激素（estrogen）、絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)（MAPK cascade）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子-酪氨酸激酶受體（BDNF-TrkB）、5-羥色胺受體（5-HT receptor)、白細(xì)胞介素（IL）等信號通路，這表明梔子豉湯作用靶點存在于多個通路，可以通過調(diào)節(jié)不同的通路來發(fā)揮抗抑郁作用。
討論
梔子豉湯由梔子和淡豆豉2味藥組成。梔子主要成分有環(huán)烯醚萜苷、梔子黃素和有機酸，其中京尼平苷、西紅花苷、西紅花酸、綠原酸和熊果酸含量較高[18-21]。研究表明，京尼平苷、京尼平[22]和西紅花苷-I[23]具有一定的抗抑郁作用；西紅花酸具有抗腫瘤和神經(jīng)保護等作用[24-28]；京尼平苷酸是京尼平苷的衍生物，具有抗炎和抗氧化等作用[29-30]；綠原酸為多種中藥中的活性成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、增強免疫力等作用[31]；熊果酸在許多人類疾病中均發(fā)揮著作用，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗病毒等作用[32]。淡豆豉中大豆異黃酮與大豆皂苷成分逐漸成為近年來的研究熱點。目前對大豆異黃酮類成分研究較多的是大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木黃酮，但也有研究表明游離苷元（大豆苷元和染料木黃酮）才是大豆異黃酮主要活性組分[33]。研究表明大豆皂苷類成分具有溶血、降低膽固醇和三酰甘油、抑制腫瘤細(xì)胞生長等作用[34]。但大豆皂苷類成分復(fù)雜，對大豆總皂苷生物功能報道的居多，而對單個大豆皂苷成分則報道較少，其中以大豆皂苷I和大豆皂苷II、大豆皂苷Ab、大豆皂苷III報道的相對較多。這表明梔子豉湯活性成分篩選具有一定的依據(jù)。
梔子豉湯活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)（圖1）結(jié)果與中藥多成分-多靶點的特點一致。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2）結(jié)果顯示梔子豉湯作用靶點并非單獨起作用，靶點間存在著相互作用關(guān)系，為一個互作的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。分子對接結(jié)果（表5）可知重要靶點與活性成分的結(jié)合能力較好，為之后網(wǎng)絡(luò)分析奠定了好的基礎(chǔ)。作用靶點的生物功能分析結(jié)果（圖3）反映了抑郁癥作為一種復(fù)雜的疾病涉及體內(nèi)多種生物過程，這與相關(guān)文獻報道一致[35-37]。
梔子豉湯作用靶點的通路分析結(jié)果顯示，MAPK級聯(lián)途徑為胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，主要包括Ras-ERK、p38MAPK等信號通路，該級聯(lián)途徑與腦的發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞膜表面受體、神經(jīng)遞質(zhì)作用和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等過程有關(guān)[38]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）為一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元的存活和功能維持上發(fā)揮著重要的作用。BDNF通過與酪氨酸激酶受體（TrkB）結(jié)合，促使CREB磷酸化，從而促進相關(guān)蛋白（如BDNF基因）的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮作用。5-HT為一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，其受體在抑郁癥的形成中起著重要的作用，為單胺特異受體藥物研發(fā)的熱點和重點。IL為重要的細(xì)胞因子，在抑郁癥炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。瘦素為一種脂肪細(xì)胞分泌的蛋白類激素，可能與腦內(nèi)結(jié)構(gòu)的改變、神經(jīng)遞質(zhì)功能、HPA軸的功能有關(guān)[39]。研究表明，血漿、中樞瘦素水平均與抑郁癥狀相關(guān)，局部中樞注射瘦素可以起到抗抑郁效果[40-41]。梔子豉湯可能通過影響血漿瘦素水平發(fā)揮作用，也可能通過影響瘦素在中樞的功能發(fā)揮作用。
雌激素對抑郁癥的發(fā)生起著重要的作用。研究表明，血清、海馬雌激素/雌激素受體水平與抑郁癥狀相關(guān)[42-43]，雌激素可以通過影響腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮抗抑郁作用[44]。梔子豉湯可能通過影響體內(nèi)雌激素水平發(fā)揮作用，也可能通過影響雌激素在腦中的功能發(fā)揮作用。提示梔子豉湯發(fā)揮作用可能是腦內(nèi)直接作用與腦外間接作用共同作用的結(jié)果。
綜上所述，篩選出的梔子豉湯16個活性成分具有一定的研究意義與依據(jù)。梔子豉湯的抗抑郁作用涉及細(xì)胞、組織、器官、代謝、免疫、對應(yīng)激的應(yīng)答等多個過程；與神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等物質(zhì)有關(guān)，通過調(diào)節(jié)瘦素、雌激素、MAPK級聯(lián)、BDNF-TrkB、5-HT受體、IL等信號通路來發(fā)揮抗抑郁作用。文獻報道與分子對接結(jié)果表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測具有一定的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果充分體現(xiàn)了梔子豉湯多成分-多靶點-多通路的抗抑郁作用特點，為進一步開展梔子豉湯抗抑郁作用機制的研究提供了新思路。此外，本課題組對梔子豉湯的活性成分及抗抑郁作用機制的實驗研究也正在進行中。
