實(shí)驗(yàn)
方法
原理
堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
簡明原理：堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA，而染色體DNA不會復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過離心除去。
實(shí)驗(yàn)材料
菌液
試劑、試劑盒
質(zhì)粒抽提試劑盒RNase ABuffer S1Buffer S2Buffer S3Buffer W1Buffer W2 concentrateEluent
儀器、耗材
DNA 制備管離心管移液槍槍頭槍頭盒離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
耗材：DNA 制備管，2 ml 離心管，1.5 ml 離心管。
RNase A：50 mg/ml，室溫保存。
Buffer S1：細(xì)菌懸浮液。加入RNase A 后，4°C 貯存。
Buffer S2： 細(xì)菌裂解液，室溫密閉貯存。(若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于37°C 溫浴溶解并冷卻至室溫后再使用。）
Buffer S3：中和液，室溫密閉貯存。
Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?00%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 第一次使用前，RNase A全部加入Buffer S1 中，4°C貯存。
2. 準(zhǔn)備無核酸和核酸酶污染的Tip頭、離心管。
3. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定體積的無水乙醇。
三、操作步驟
1. 取1-4 ml 在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液（若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少），12 000×g 離心1 min，棄盡上清。
2. 用250 μl 已加入RNase A 的Buffer S1 懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。
3. 加入250 μl Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6 次均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5 min。
4. 加入350 μl Buffer S3，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8 次，12 000×g 離心10 min。
步驟5～7 可以選擇負(fù)壓法或離心法純化質(zhì)粒DNA。
A. 負(fù)壓法
5A. 將質(zhì)粒DNA 制備管插到負(fù)壓裝置的接口上。吸取步驟4 中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管中，開啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-20-30 英寸汞柱，緩慢吸走管中溶液。
6A. 加500 μl Buffer W1，吸盡管中溶液。
7A. 加700 μl Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。
B. 離心法
5B. 吸取步驟4 中的離心上清并轉(zhuǎn)移到DNA 制備管（置于2 ml 離心管中），12 000×g 離心1 min。
6B. 將制備管置回離心管，加500 μl Buffer W1，12 000×g 離心1 min，棄濾液。
7B. 將制備管置回離心管，加700 μl Buffer W2，12 000×g 離心1 min， 棄濾液；以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。棄濾液。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇。
8. 將制備管置回2 ml 離心管中，12 000×g 離心1 min。
9. 將制備管移入新的1.5 ml 離心管中，在DNA 制備膜正中央加60-80 μl 水或Eluent，室溫靜置1 min。12 000×g 離心1 min。
收起
注意事項(xiàng)
1. Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢。
2. 本試劑盒為AxyPrep 質(zhì)粒DNA小量試劑盒，適合于從1-4 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至20 μg 高純的質(zhì)粒DNA。
