circRNA通過吸附miRNA發(fā)揮作用的文章已經(jīng)比較多了，今天我們來看一篇miRNA調(diào)控circRNA的文章：

MicroRNA-1224 splicing circularRNA-Filip1l in an Ago2- dependent manner regulates chronic inflammatory pain via targeting Ubr5. J Neurosci. 2019 Jan 16. pii: 1631-18. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1631-18.2018.

microRNA-1224介導Ago2剪接調(diào)控circRNA-Filip1l通過靶向Ubr5調(diào)控慢性疼痛

論文第一作者為潘志強教授、碩士生李國芳和孫夢蘭，曹君利教授和潘志強教授為共同通訊作者：

來源:徐州醫(yī)科大學官網(wǎng)

http://www.xzhmu.edu.cn/info/14625/253482.htm

一、研究背景

• miRNA通過AGO2調(diào)控circRNA表達已有文章：

miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circularantisense RNA.EMBO J. 2011 Sep 30;30(21):4414-22. doi: 10.1038/emboj.2011.359.

在這篇文章中，miR-671通過Ago2調(diào)控CDR1的circRNA發(fā)揮功能：

• MicroRNA-1224在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達豐度較高，且與帕金森癥有關；

• circRNA-Filip1l在腦組織高表達；

二、文章思路和結果

1. circRNA-Filip1l的確定及基本特性研究

• 首先通過芯片對CFA誘導的慢性炎癥疼痛的小鼠與對照組進行檢測，共找到16個顯著上調(diào)和34個顯著下調(diào)2倍以上的circRNA，其中CircRNA-005252顯著差異倍數(shù)最高，另外又隨機挑選了1條顯著升高和2條顯著降低的circRNA通過PCR進行驗證，CircRNA-005252表達倍數(shù)顯著上調(diào)2.8倍；

• 接下來對CircRNA-005252進行PCR擴增后進行Sanger測序，并檢測CircRNA-005252對RNase R降解的敏感性；

• 然后通過Northern Blot檢測CircRNA-005252；

• 最后細胞質(zhì)核分離后PCR和熒光原位雜交檢測CircRNA-005252的細胞內(nèi)定位與分布，結果發(fā)現(xiàn)胞漿和胞核均有分布。

2. circRNA-Filip1l的時序和細胞/區(qū)域表達特異性檢測

• 首先是在CFA誘導的慢性炎癥疼痛模型中circRNA-Filip1l表達的時序（2h-1d-3d-5d-7d-14d）和脊髓背側角和脊髓前角表達的區(qū)域特性；

• 接下來是在CCI小鼠模型中的表達，結果發(fā)現(xiàn)circRNA-Filip1l不僅在慢性炎性疼痛（CFA）還在慢性神經(jīng)病理性疼痛（CCI）中發(fā)揮作用；

• 最后是circRNA-Filip1l在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細胞的分布，結果發(fā)現(xiàn)在circRNA-Filip1l主要在神經(jīng)元內(nèi)分布。

3. circRNA-Filip1l對疼痛感受的影響

這里就是我們常說的細胞和動物水平的功能實驗了，對circRNA-Filip1l分別進行沉默和過表達（各用兩種技術），然后檢測溫度和機械疼痛表型。

4. circRNA-Filip1l的表達被miR-1224調(diào)控 

• 由于circRNA-Filip1l定位于細胞核，而研究發(fā)現(xiàn)（背景介紹中的EMBO J 文章）miRNA可通過結合細胞核內(nèi)的circRNA調(diào)控其表達，因此考慮從miRNA角度研究circRNA-Filip1l表達調(diào)控機制；
  

• 對circRNA-Filip1l和前體circRNA-Filip1l的序列預測發(fā)現(xiàn)miRNA-1224；

• miRNA-1224也定位于細胞核，且時序/細胞表達模式與circRNA-Filip1l類似；

• 通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蜕锼貥擞浀膍iRNA-1224進行pulldown檢測；

• 最后對miRNA-1224的表達進行干預后檢測circRNA-Filip1l表達。

5. miR-1224通過circRNA-Filip1l調(diào)控疼痛感知

這里的工作主要就是圍繞miR-1224展開了，有點像circRNA-Filip1l的功能研究，我們單獨看為了證明miR-1224通過circRNA-Filip1l發(fā)揮作用，這個回復實驗是怎么做的：

6. Ago2介導miR-1224對circRNA-Filip1l的剪切

• 之所以考慮Ago2，原因還是EMBO J文章；

• 通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?/strong>研究Ago2對miRNA-1224調(diào)控circRNA-Filip1l的影響；

• Ago2的抗體進行RIP發(fā)現(xiàn)miRNA-1224和pre-circRNA-Filip1l；

• 通過功能實驗和回復實驗進一步證明Ago2在miRNA-1224調(diào)控circRNA-Filip1l的作用。

7.CircRNA-Filip1l通過調(diào)控Ubr5表達發(fā)揮作用

前面的工作主要圍繞circRNA-Filip1l的上游機制展開，建立了miRNA-1224/Ago2/circRNA-Filip1l的調(diào)控軸，這一部分主要講的是circRNA-Filip1l的下游機制和靶基因。

• 研究發(fā)現(xiàn)核circRNA通過招募RNA聚合酶II調(diào)控基因表達，因此考慮circRNA-Filip1l是否存在這樣的作用機制；

• 通過BLAST 對circRNA-Filip1l的可能靶基因進行預測，在預測到的42個基因中，尋找與疼痛有關的分子，其中Ubr5可活化NMDA受體；

• 接下來是對circRNA-Filip1l調(diào)控Ubr5的驗證了，這里包括了circRNA-Filip1l與Ubr5結合位點的預測、熒光素酶報告基因?qū)嶒炑芯縞ircRNA-Filip1l對Ubr5轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控、circRNA-Filip1l對Ubr5表達的影響、Ubr5與miRNA-1224/Ago2/circRNA-Filip1l等表達的相關性以及Ubr5的功能等。

三、文章總結

通過示意圖來展示文章的研究結果：

最后我們拋磚引玉說一下對這篇文章的理解：

1. 如同題目所說，這篇文章說的是miRNA對circRNA的調(diào)控，circRNA吸附miRNA的研究比較多，而反過來的調(diào)控模式則比較少。另外，這里還涉及到circRNA的表達異常的幾種機制，如果感興趣可以看這些綜述：

• The Biogenesis, Functions, and Challenges of Circular RNAs.Mol Cell. 2018 Aug 2;71(3):428-442. 

• Regulation of circRNA biogenesis.RNA Biol. 2015;12(4):381-8.

• A 360° view of circular RNAs: From biogenesis to functions.Wiley Interdiscip Rev RNA. 2018 Jul;9(4):e1478. 

2. circRNA的下游調(diào)控方式：在這篇文章中circRNA通過招募Pol II調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，這種作用方式已經(jīng)在lncRNA里面有研究，但在circRNA的作用機制里面還是相對較少的；

3. 移植研究的一種模式：從基礎研究找思路，到對應的疾病中去。

４. 這篇文章的工作量不少，發(fā)表的雜志分數(shù)（IF 5.97）似乎低了一些？