膠質母細胞瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見和最具侵襲性的原發(fā)性惡性腫瘤。目前其治療措施主要是化療和放療，通過靶向增殖的腫瘤細胞，但也因此殺傷正常增殖的細胞導致毒副作用；而相對靜息的腫瘤干細胞則有可能逃避這類常規(guī)的治療策略。腫瘤干細胞的代謝特性與增殖期的腫瘤細胞和體細胞不同，快速增殖的腫瘤細胞依賴有氧糖酵解 ( 即眾所周知的Warburg效應 ) ，但慢更新的腫瘤干細胞可能更依賴線粒體呼吸作為主要的能量來源。
氧化磷酸化 ( OXPHOS ) 在細胞的能量代謝中起著核心作用。OXPHOS由核基因組和線粒體基因組編碼的90多種蛋白質組成。OXPHOS電子傳遞鏈由四種復合物(I到IV)組成，它們將TCA循環(huán)和脂肪酸氧化生成的電子從供體轉移到氧。復合物I至IV將質子泵入線粒體膜間隙，增加線粒體膜內pH值，形成電壓梯度。復合物V ( F0F1 ATP合酶 ) 利用質子梯度中儲存的能量產生ATP?；钚匝跏请娮觽鬟f鏈和ATP合成過程中產生的副產物，通過線粒體通透性轉變孔 ( mPTP ) 等多種機制可以減輕其毒副作用。
近日，美國Memorial Sloan Kettering腫瘤中心的研究人員最近在《Nature》上報道了靶向氧化磷酸化來殺傷膠質母細胞瘤的首個全新小分子Gboxin，并可以有效致死膠質母細胞瘤干細胞。
大部分基于細胞的“抗癌”藥物篩選研究主要是干擾有絲分裂、DNA復制或損傷修復。為了區(qū)分癌細胞和正常分裂的細胞，研究人員構建了基于原代膠質母細胞瘤細胞的高通量篩選體系。他們首先建立了一個自發(fā)的膠質母細胞瘤小鼠模型，在GFAP-cre轉基因介導的重組下，三個GBM相關腫瘤抑制因子 ( Trp53、Pten和Nf1 ) 發(fā)生突變導致小鼠自發(fā)膠質母細胞瘤；然后將多個GBM腫瘤低傳代球狀培養(yǎng)物混勻成細胞池，建立原發(fā)性高通量GBM球狀細胞系 ( High-throughput GBM sphere, HTS ) 用于高通量篩選，利用96-h Cell-Titer-Glo的方法在上述細胞上篩選了200,000個化合物。
為了排除非特異性或抗有絲分裂的毒性，他們還對初級低傳代小鼠胚胎成纖維細胞 ( MEFs ) 、新生星形膠質細胞和初級腦室下區(qū)神經干細胞和祖細胞進行了差異性篩選，最終篩選出61個IC50在nM級別的化合物。S9 fraction和hepatocyte assays進一步復篩這61個化合物，得到了17個潛在藥物代謝較好的化合物，并依據(jù)化學結構可改造性選定了最終的3個化合物，其中包括Gboxin。Gboxin ( IC50 = 150 nM ) 及其衍生物均可以特異性抑制HTS細胞的生長，且不抑制初生MEFs或星形膠質細胞的生長。
Gboxin處理 6小時后的幾種常見的癌癥相關信號轉導通路中，發(fā)現(xiàn)ATF4上調，并在時間上伴隨著磷酸化S6 ( phospho-S6 ) 水平的降低。加藥處理24 h內，HTS細胞發(fā)生細胞周期阻滯，G1、G0與S期比值增加，3天后出現(xiàn)細胞凋亡的分子特征。因此，Gboxin引起了原代GBM細胞的快速和特異性反應，導致細胞死亡，且對原代MEFs或星形膠質細胞的中沒有表現(xiàn)明顯抑制生長的作用。
由于Gboxin持續(xù)給藥后，HTS細胞的膜電位降低，而MEFs細胞沒有。研究者進行了耗氧量 ( Oxygen Consumption Rate, OCR ) 測量，發(fā)現(xiàn)了Gboxin對OCR的抑制作用呈濃度依賴性變化，與OXPHOS的抑制劑一樣有效。Gboxin對HTS細胞具有獨特的殺傷性，它對MEFs和星形膠質細胞OCR耗竭會在30小時左右恢復；相反，OXPHO的抑制劑魚藤酮、抗霉素 A和寡霉素均可急性和慢性地抑制所有細胞的OCR。這些數(shù)據(jù)表明，Gboxin可能是通過破壞HTS細胞中的代謝來發(fā)揮抑制作用。
研究人員利用Gboxin類似物偶聯(lián)生物素 ( B-Gboxin, IC50 = 1530 nM ) 構建了用于把靶標識別的探針。質譜分析Gboxin、B-Gboxin和兩者聯(lián)合使用處理HTS細胞的pull down樣品，確定Gboxin特異性相互作用的靶標是處于線粒體的蛋白。在58種潛在的蛋白質中，其中12種是OXPHOS機制的組成部分；來自所有OXPHOS復合物的成分都存在，其中以復合物V(拉下5個蛋白)最具代表性。他們使用復合物I、II、IV和V組分的特異性抗體進行相互作用的確認，與不同OXPHOS抑制劑對比發(fā)現(xiàn)，線粒體上的復合物V是Gboxin介導的細胞死亡的功能靶標。
利用Gboxin的光交聯(lián)類似物 ( C-Gboxin， IC50 = 350 nM ) 發(fā)現(xiàn)，HTS細胞線粒體中C-Gboxin含量較高。相反，對Gboxin不敏感的MEFs顯示C-Gboxin的線粒體積累有限，當加入CsA后，會導致C-Gboxin的線粒體積累。這些數(shù)據(jù)驗證了前面的生化數(shù)據(jù)，表明Gboxin在腫瘤細胞線粒體中有特異性的積累，且是通過影響線粒體通透性來實現(xiàn)在線粒體的累積。
接下來，研究人員在三種獨立的原代小鼠GBM培養(yǎng)物和三種GBM患者源性培養(yǎng)物上都測試了Gboxin的活性。結果顯示，實驗中所有的GBM細胞都對Gboxin的敏感，小鼠GBM細胞IC50更低，約為150nM，人類GBM細胞約為1μM。
他們還在常見的不同類型的人類腫瘤細胞系上檢測Gboxin的效果。與野生型的MEFs和星形膠質細胞對Gboxin不敏感相比，大多數(shù)癌細胞系對gboxin敏感，并顯示出一定的治療效果。OCR檢測證實了細胞系中Gboxin 處理偶聯(lián)呼吸抑制。
為了更好的將Gboxin用于臨床前研究，研究人員優(yōu)化了其結構，獲得了S-Gboxin ( IC50 = 470 nM ) ，具有良好的代謝穩(wěn)定性，優(yōu)異的血漿穩(wěn)定性和藥代動力學特性，適用于體內研究。在小鼠移植瘤模型上，HTS細胞移植后第3天或第14天開始給藥S-Gboxin 10 mg/kg /天來評估其體內抗腫瘤活性。與對照組相比，使用S-Gboxin治療的小鼠腫瘤體積、細胞密度和增殖均有所減少，存活率有所提高。使用S-Gboxin治療的腫瘤降低了高級別膠質瘤標志物GFAP和OLIG2的表達。在基底膜基質的存在下，原發(fā)人GBM細胞也被注射到免疫缺陷小鼠的側翼進行病人樣本移植瘤模型的建立。在第3天檢測到可見腫瘤后，每日給予S-Gboxin，給予10mg/kg/天，與對照組相比，腫瘤細胞生長明顯減緩，細胞密度下降。
在原位瘤模型上，為了克服血腦屏障穿透性差的問題，使用導管輸送藥物來測試顱內抗腫瘤活性。原代小鼠GBM細胞經原位移植，然后進行為期兩周的腫瘤接種期和術后恢復；在這之后，在注射部位植入導管，通過皮下微型泵原地輸送S-Gboxin（ 每只鼠每天2.16μg ）。S-Gboxin治療抑制腫瘤生長，表現(xiàn)為減少出血、細胞密度和增殖。組織病理學分析進一步顯示高等級膠質瘤標志物表達降低。
研究人員還測試了兩個獨立的病人來源的異種移植 ( PDX ) 模型。從有癥狀的PDX小鼠P0身上收集新鮮的病人移植GBM，病人腫瘤1勻漿，病人腫瘤2分離成單細胞，原位植入到四只老鼠的腦中，每一只都沒有額外的操作，獲得P1。兩周 ( 患者腫瘤1 ) 或四周 ( 患者腫瘤2 ) 后，植入微型泵將安慰劑或S-Gboxin輸送到腫瘤區(qū)域。所有經載藥治療的小鼠均表現(xiàn)出發(fā)病癥狀 ( 41-65天 ) ，并被殺進行分析。S-Gboxin抑制GBM PDX的生長，表現(xiàn)為一般健康狀況，降低細胞密度，細胞增殖和GBM標志物的表達。
盡管每天在體內給藥超過四周或更長時間，但在使用S-Gboxin治療的小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)體重減輕或明顯的一般健康缺陷跡象。研究人員還檢查了S-Gboxin顱內治療后腦室下區(qū)神經干細胞生境的狀況。對照實驗顯示，給安慰劑和Gboxin小鼠的內源性巢蛋白染色沒有異常，而治療后腫瘤內的巢蛋白陽性細胞明顯減少。
從腫瘤樣本發(fā)現(xiàn)新靶標先導化合物的篩選方法意味著發(fā)現(xiàn)的化合物可能更直接面向臨床需求，從提高藥理模型的“臨床效果可預測性”。本研究發(fā)展的高通量篩選方法不同于我們常規(guī)使用的體外系統(tǒng)或者模式細胞系統(tǒng)，是利用體內瘤細胞來建立篩選，這個模型一方面更加近似于腫瘤發(fā)生的原生環(huán)境，另外這個模型還考慮到了潛在的腫瘤干細胞問題。
對于全新靶標的First-in-class藥物發(fā)現(xiàn)而言，每一步都是前人未知的，雖然市場前景收益巨大，臨床前即使在小鼠模型上有優(yōu)異的效果，臨床II期在人體治療的結果才是真正的第一個考驗。因此，利用更近似真實發(fā)病的藥理模型和人源化評價方法，將大大提高藥物在臨床II期的折損率，考慮到我國龐大的臨床資源，這將成為未來我國創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)中一大優(yōu)勢。
