CAR-T細(xì)胞療法徹底改變了難治性，復(fù)發(fā)性惡性血液病的治療方法。靶向B細(xì)胞表面抗原CD19的CAR-T療法使得B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞淋巴瘤患者得到了持續(xù)性緩解。盡管CAR-T療法取得了長足的進(jìn)步，但腫瘤細(xì)胞仍然存在著多種逃逸機(jī)制躲避CAR-T的殺傷，這其中最主要的就是靶抗原的丟失，在這里，我們重點闡述迄今為止靶向CD19CAR-T細(xì)胞療法所取得的成果，介紹單靶向治療的局限性，闡述腫瘤逃逸機(jī)制，最終討論多靶向性策略解決腫瘤逃逸問題。
基因修飾的自體T細(xì)胞過繼療法在難治性，復(fù)發(fā)性惡性血液病方面取得了長足的進(jìn)步。T細(xì)胞可以通過基因工程化表達(dá)新的T細(xì)胞受體（TCR）,或者表達(dá)嵌合抗體原受體（CAR）靶向腫瘤相關(guān)抗原。CAR修飾的T細(xì)胞包含一個抗體可變區(qū)單鏈（scFV）來靶向腫瘤表面抗原，融合表達(dá)一個跨膜結(jié)構(gòu)域，一個胞內(nèi)共刺激信號結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域通常由CD28或4-1BB和CD3ζ組成。盡管臨床研究表明有眾多腫瘤表面抗原可用于CAR-T細(xì)胞治療，然而目前只有針對B細(xì)胞表面CD19的CAR-T治療在臨床治療中取得了更加喜人的成績。CD19是一個分子量95KDa的糖蛋白，常表達(dá)于B細(xì)胞表面，貫穿于B細(xì)胞早期分化一直到漿細(xì)胞階段。CD19作為第一個理想的CAR-T靶標(biāo)，因為它主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞表面，未曾發(fā)現(xiàn)表達(dá)于其它造血干細(xì)胞表面以及絕大多數(shù)正常組織表面。靶向CD19的CAR-T細(xì)胞在復(fù)發(fā)性，難治性B細(xì)胞淋巴瘤治療方面都有顯著療效。眾多治療相關(guān)報道顯示靶向CD19的CAR-T細(xì)胞具有治療非霍奇金淋巴瘤的潛能。從鮮有報道到臨床數(shù)據(jù)爆炸性增長，如今，源源不斷的臨床數(shù)據(jù)從多個治療研究中心相繼傳來。盡管這些研究表明CAR-T治療取得了空前的療效，但是靶向CD19的CAR-T治療并不是所向披靡。部分患者仍舊對其沒有反應(yīng)，甚至有人治療前期有效，后期產(chǎn)生了耐受。最初把這一耐受性機(jī)制歸因于腫瘤細(xì)胞表面CD19表達(dá)量的下調(diào)。
迄今為止，三項研究報道了在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞淋巴瘤取得了有效進(jìn)展。首先在在B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤治療方面，Neelapuet al等人報道了ZUMA-1（CD28CD3ζCAR-19-T）在復(fù)發(fā)性，難治性B細(xì)胞淋巴瘤二期臨床數(shù)據(jù)，通過對108位患者治療后一年的追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，42%的患者有持續(xù)效果。在一組復(fù)發(fā)性且數(shù)據(jù)有效的患者中，CD19陰性被視為導(dǎo)致治療失敗的可能機(jī)制。Juliet研究小組評估了41BBCD3ζ CAR-19-T的療效，二期臨床試驗中，在對93位患者治療后三個月的追蹤調(diào)查顯示完全緩解率為32%。41BBCD3ζCAR-19-T療法同時也在復(fù)發(fā)性，難治性兒童和年輕患者進(jìn)行了試驗，治療后三個月的追蹤調(diào)查顯示，完全緩解率分別達(dá)到了81%和59%。得到緩解的病人仍然健在，病情未復(fù)發(fā)已達(dá)12個月。那些復(fù)發(fā)病人中，絕大多數(shù)（15/22）為CD19陰性患者，這也是目前FDA已批準(zhǔn)的CAR-T療法的主要局限。盡管一些臨床研究表明，替代靶點CD22有很好的治療前景，對于CD19陰性復(fù)發(fā)患者來說，已批準(zhǔn)的療法選擇面很小，且預(yù)后一般都很差。本文主要聚焦由于靶向抗原的丟失，造成CAR-T治療失敗的機(jī)制，提出新的CAR構(gòu)造策略來應(yīng)對當(dāng)前CAR-T治療的困惑。
盡管與傳統(tǒng)療法相比，早期CAR-T療法在復(fù)發(fā)性，難治性B細(xì)胞瘤方面有顯著的療效，然而，也有不少患者對CAR-T療法失效，部分患者CAR-T治療初期有反應(yīng)后期復(fù)發(fā)。已知的逃逸機(jī)制中，最明確的復(fù)發(fā)病因?qū)W歸咎于抗原丟失。最新的臨床數(shù)據(jù)顯示CD19CAR-T細(xì)胞治療B-ALL,7%-33%初期應(yīng)答患者，后期復(fù)發(fā)歸因于細(xì)胞表面抗原CD19的丟失，這一結(jié)果支持了Schreiber及其同事在2002年提出的免疫編輯假說。CD19丟失最早發(fā)現(xiàn)于CAR-T治療的B-ALL患者過程中，患者治療早期完全緩解，2個月后復(fù)發(fā)。在患者未感到身體不適的情況下，深度測序顯示，事實上血液中已有了CD19陰性惡性細(xì)胞克隆，23天后發(fā)現(xiàn)于骨髓中。
隨著對抗原丟失造成的CAR-T治療局限的認(rèn)識，許多研究表明存在多種機(jī)制影響抗原丟失（如圖1）。Sotillo等揭示，在兒童B細(xì)胞瘤治療中，伴隨著CAR-19-T的治療，出現(xiàn)了CD19獲得性突變和CD19等位基因的選擇性剪切，這一結(jié)果導(dǎo)致了細(xì)胞表面未表達(dá)CD19和表達(dá)CD19突變體的惡性細(xì)胞不再受CAR-T細(xì)胞的識別和殺傷。Fischer等人的一項研究表明，CD19的一個變體形式缺少CAR-T識別的表位，這也預(yù)示了這些患者治療的失敗。當(dāng)然，以上這些結(jié)果也遭受到了不同學(xué)者的質(zhì)疑，在一項最新的研究結(jié)果中，一組12人B-ALL患者抗原丟失歸因于多種雜合突變丟失，鮮有選擇性剪切缺失。Bagashev等人在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)現(xiàn)了保留的突變，錯誤折疊的CD19，這也預(yù)示著可能存在另一種抗原丟失的機(jī)制。
圖1.逃避CAR-T殺傷的機(jī)制
(A)腫瘤細(xì)胞通過基因突變（I）完全喪失CD19受體表達(dá)或者（II）轉(zhuǎn)變?yōu)?/strong>CD19CAR不能識別或者結(jié)合的結(jié)構(gòu)。（B）腫瘤細(xì)胞發(fā)生譜系轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)變?yōu)?/strong>CD19陰性。（C）慢病毒飄移導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)CAR,造成CAR-T細(xì)胞無法識別腫瘤細(xì)胞。
CAR-T細(xì)胞治療后抗原丟失的另一個機(jī)制是細(xì)胞譜系的轉(zhuǎn)變。2015年，Evans和他的同事第一次報道了譜系轉(zhuǎn)變，一位CLL患者CAR-T治療后復(fù)發(fā)發(fā)生了Richter轉(zhuǎn)換，這一患者漿細(xì)胞天生就是CD19陰性。緊接著另一報道也發(fā)現(xiàn)了類似譜系轉(zhuǎn)化，7位CD19陰性的急性髓性白血病患者中的2位在接受了CAR-T治療后轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌献V系重排B-ALL。最近有報道稱有TCF3-ZNF384融合陽性B-ALL兒童患者在治療后發(fā)生了髓系轉(zhuǎn)換。最新的研究報道，Ruella等人提出了CD19新的免疫逃逸機(jī)制。一例CD19陰性患者在CAR-T治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)換為單細(xì)胞CD19陽性白血病，而造成這一結(jié)果的原因正是由于CAR-T治療過程中使用的慢病毒飄移，造成白血病細(xì)胞表面表達(dá)CD19CAR且CD19CAR順式結(jié)合與白血病細(xì)胞表面的CD19,使得CD19CAR-T細(xì)胞無法識別這些白血病細(xì)胞。盡管這種現(xiàn)象鮮有所見，但是它不失為一種耐受機(jī)制，這就要求在CAR-T設(shè)計生產(chǎn)過程中執(zhí)行嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來確保免疫治療的安全。
部分抗原丟失歸因于抗原表達(dá)下調(diào)，和抗原表達(dá)完全喪失一樣，也是CAR-T治療耐受的一種機(jī)制。在應(yīng)用CAR20治療過程中，Murata和他的同事報道了發(fā)生溶細(xì)胞作用和刺激釋放細(xì)胞因子所需要細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)量的臨界值，其中溶細(xì)胞作用至少要求細(xì)胞表面有200個表面抗原分子，而刺激細(xì)胞因子釋放至少要多達(dá)2000個分子以上。另一項研究表明，CD30CAR靶向白血病細(xì)胞而不破壞造血干細(xì)胞的原因是表面抗原差異性的表達(dá)水平。造血干細(xì)胞表面低水平的CD30不足以引起溶細(xì)胞作用，而白血病細(xì)胞表面CD30的高表達(dá)能有效的被CD30CAR識別，起到相應(yīng)的治療效果。Mackal等人報道了不僅腫瘤細(xì)胞表面抗原分子的密度影響著CAR-T治療效果，CAR-T細(xì)胞表面CAR分子的表達(dá)量同樣影響著CAR-T的治療效果。最新的研究報道顯示，CD22CAR-T治療后復(fù)發(fā)的患者顯示B-ALL細(xì)胞表面同樣存在著表面抗原分子表達(dá)量降低的現(xiàn)象。另一動物試驗證實，白血病細(xì)胞表面CD22的差異化表達(dá)帶來戲劇性的抗癌療效，這些結(jié)果將不僅在CAR-T治療惡性血液腫瘤方面有指導(dǎo)意義，實體瘤治療方面有也有很高的指導(dǎo)意義。
B細(xì)胞白血病在CAR-T治療后抗原現(xiàn)象的存在毋庸置疑，對于淋巴瘤患者抗原丟失評估而言，流式細(xì)胞術(shù)檢測，相對于免疫組化評估抗原表達(dá)水平應(yīng)用于評估抗原丟失方面更具挑戰(zhàn)。Shalabi等人的研究結(jié)果表明，抗原丟失在淋巴瘤患者中扮演重要角色，CAR-T治療后，CD19,CD22抗原相繼消失。顯而易見，淋巴瘤患者在經(jīng)歷CAR-T治療后抗原丟失評估的復(fù)雜性需要更加全面可靠的方法來衡量其發(fā)生的頻率。
比較容易解決CAR-T治療后抗原丟失現(xiàn)象的方法是靶向多個抗原。這個可以通過一下四種方案里的一種解決。（1）分別生產(chǎn)2種或者更多種針對不同靶點CAR-T細(xì)胞，混合或者相繼輸注給患者，（2）通過雙順反子表達(dá)載體在同一細(xì)胞表面共表達(dá)兩種CAR,(3)共轉(zhuǎn)導(dǎo)：設(shè)計2種不同結(jié)構(gòu)的CAR載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，使其共表達(dá)識別兩種不同抗原或者僅識別一種抗原的CAR-T混合細(xì)胞群。（4）串聯(lián)表達(dá)兩種CAR，在同一表達(dá)載體上串聯(lián)表達(dá)兩種CAR蛋白。以上方法在最近Majznerand Mackall綜述里都有報道（如圖2）。
圖2.多靶向CAR-T策略
（A）單獨生產(chǎn)2種或者多種針對不同靶點CAR-T細(xì)胞，混合或者相繼輸注給患者，（B）通過雙順販子表達(dá)載體在同一細(xì)胞表面共表達(dá)兩種CAR,(C)共轉(zhuǎn)導(dǎo)：設(shè)計2種不同結(jié)構(gòu)的CAR載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，產(chǎn)生共表達(dá)識別兩種不同抗原或者僅識別一種抗原的CAR-T混合細(xì)胞群。（D）串聯(lián)表達(dá)兩種CAR，在同一表達(dá)載體上串聯(lián)表達(dá)兩種CAR蛋白。
主張使用多個CAR來避免抗原丟失應(yīng)用于膠質(zhì)瘤治療的研究是多靶標(biāo)CAR-T早期應(yīng)用于臨床的研究之一。在此研究中，科學(xué)家設(shè)計了單獨針對HER2和針對IL-13Rα2特異性的CAR,通過給患者輸注HER2CAR-T和IL-13Rα2CAR-T混合細(xì)胞群，或者按次序輸注的方式，來防止抗原丟失造成的治療失敗，兩種方法都有效阻止了因抗原丟失造成的逃逸，都取得了較好的抗癌效果。Zah等人開發(fā)了一種CD19-CD20雙CAR,并證明了該雙重結(jié)構(gòu)能有效阻止CD19陰性腫瘤細(xì)胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的自發(fā)發(fā)展。
2016年晚些時候，Gill和他的同事們應(yīng)用上述3和4提到的方法，他們構(gòu)建了同時靶向CD19和靶向CD123的CAR結(jié)構(gòu)，通過靶向CD19,CD123的CAR-T混合群，或者共表達(dá)CD19,CD123的CAR-T細(xì)胞，在小鼠異體移植瘤模型上顯示有良好的阻止抗原丟失和抗腫瘤作用。
Schneider等人報道了CD19-CD20串聯(lián)表達(dá)CAR-T治療的臨床前研究，針對CD19和CD20的CAR以CD19-CD20,或者CD20-CD19串聯(lián)表達(dá)的形式表達(dá)于CAR的胞外區(qū)。白血病異體移植瘤模型顯示，無論是CD19-CD20CAR或者CD20-CD19CAR,其治療效果都明顯優(yōu)于CD19CAR。CD19表達(dá)于Raji細(xì)胞表面，與CD19CAR-T細(xì)胞共孵育后，其表達(dá)量顯著降低，但是與CD19-CD20,CD20-CD19CAR-T共孵育后CD19仍然保持高水平表達(dá)。有趣的是，與CD20CAR-T相比，串聯(lián)表達(dá)CD19-CD20CAR-T細(xì)胞在經(jīng)歷了抗原陽性白血病細(xì)胞刺激后，其細(xì)胞因子分泌量較低，這就預(yù)示著當(dāng)CD19,CD20CAR串聯(lián)共表達(dá)的時候存在某種信號衰減機(jī)制。最后，在高負(fù)荷小鼠白血病模型上，CAR2019T細(xì)胞，無論與CD19,CD20單CAR-T或者CD19,CD20混合CAR-T細(xì)胞群相比，都顯示出了更好的治療效果。體外實驗中，無論在CAR19的遠(yuǎn)端表達(dá)CAR20還是在近端表達(dá)，并沒有明顯的治療優(yōu)勢，但是CAR2019卻能更好的結(jié)合CD20多肽，起到更好的抗腫瘤作用。這一臨床前研究已轉(zhuǎn)化為臨床1期實驗，試驗號(NCT03019055)，靶向人CD19-CD20雙靶向CAR-T治療。在經(jīng)過治療后復(fù)發(fā)的嚴(yán)重B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者中應(yīng)用CAR20.19-T細(xì)胞治療，早期劑量爬坡實驗顯示，3/6患者存在持續(xù)性的完全緩解和部分緩解。有趣的是，在進(jìn)展或復(fù)發(fā)的三名患者中，所有人隨后活檢顯示，都保留了CD19或CD20陽性，提示治療失敗的病因不是抗原丟失，而是其他機(jī)制。
類似于CD20.CD19CAR-T設(shè)計，Fry和他的同事們開發(fā)了一種CD19-CD22的CAR,體外實驗顯示,CAR-T細(xì)胞能有效殺傷CD19+和CD22+的人類白血病細(xì)胞，分泌IFN-γ作用于靶細(xì)胞，體內(nèi)實驗顯示，CD19-CD22CAR-T細(xì)胞能有效清除白血病細(xì)胞，一項關(guān)于復(fù)發(fā)性，難治性彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤以及B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病一期臨床試驗正在進(jìn)行，早期劑量爬坡實驗結(jié)果顯示7位患者中2位出現(xiàn)完全緩解。
如下圖表1列舉，由于鼓舞人心的臨床前實驗結(jié)果，許多串聯(lián)CAR-T,聯(lián)合CAR-T,以及分階段的多CAR-T治療方案正在臨床試驗，，同時也包含武裝華的CAR-T,表達(dá)CD19受體，CD3和CD28信號基序，共刺激信號分子配體4-1BBL,同時攜帶自殺式基因安全系統(tǒng)，以防止出現(xiàn)的急性嚴(yán)重細(xì)胞毒性，盡管這種載體構(gòu)建的CAR不能靶向多分子，但是武裝華CAR-T的治療思想是一開始劇烈的殺傷作用不給腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)喪失逃逸的機(jī)會。
表1.臨床試驗階段的多靶向CAR-T
一種有趣的方式來自與Vie和他同事先前工作的改進(jìn)，一種表達(dá)CD16(FcγRIII))CAR-T細(xì)胞可以介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性（ADCC）,針對CD16的一代CAR結(jié)構(gòu)包含CD16胞外胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。最近，CD16CAR被加上了CD3ζ和CD28或4-1BB。Caratelli等人在使用CD16CAR-T細(xì)胞治療過程中伴隨加入了一種或多種腫瘤相關(guān)抗原單克隆抗體來促進(jìn)抗體依賴的細(xì)胞毒性作用。這是一個很有吸引力的方法，因為它允許多靶點刺激作用，只要每個單克隆抗體可以介導(dǎo)ADCC作用。兩項CD16CAR-T細(xì)胞協(xié)同CD20抗體治療惡性B細(xì)胞瘤的臨床試驗正在患者招募進(jìn)行中(NCT02776813,NCT02315118)。
其它處在研發(fā)階段的武裝華的CAR包括分泌IL-18的CD19或MUC16CAR,它們似乎可以調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)環(huán)境，包括惡性血液病和實體瘤，同時可以增強(qiáng)固有免疫反應(yīng)起到抗腫瘤的作用。相同特性的CAR被修飾為共表達(dá)PD-1阻斷部分和分泌IL-12。有趣的是，腫瘤部位局部阻斷PD-1可以增強(qiáng)CAR-T抗腫瘤的效果，同時規(guī)避了PD-1阻斷劑協(xié)同作用時產(chǎn)生的毒副作用。分泌IL-12的MUC16CAR通過清除腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)CART細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性，改變腫瘤微環(huán)境。最后，值得注意的是三價CAR的研發(fā)已有報道，這將非常有趣，當(dāng)下和將來多靶點CAR-T能否解決抗原丟失問題，只有等時間能證明。
于當(dāng)下治療標(biāo)準(zhǔn)相比，多靶點CAR-T盡管存在著潛在的優(yōu)勢，然而，安全性，有效性，可操作性都是有待解決的問題。首先多靶點不能解決除了抗原丟失其它機(jī)制引起的耐藥。最近，F(xiàn)raietta等人報道了CD19CAR-T在治療CLL患者過程中有效性和耐藥性的決定性因素。他們證明了CAR-T細(xì)胞內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄組特征決定了CAR-T的療效。在響應(yīng)患者體內(nèi)，CAR-T細(xì)胞富含記憶相關(guān)基因和IL6/STAT3信號，在未響應(yīng)患者體內(nèi)未見T細(xì)胞增殖和衰竭相關(guān)基因的上調(diào)。其它可能機(jī)制包括腫瘤細(xì)胞表面PD-L1參與抑制CAR-T殺傷作用。以上兩種情況下，多靶向都不能解除耐藥機(jī)制，其二，多靶點CAR-T細(xì)胞在患者體內(nèi)的安全性和活性的研究還很少，很可能多靶點通過增加多靶向性會引起更強(qiáng)的細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而多靶點CAR-T治療不可用。目前還不清楚體內(nèi)的細(xì)胞毒性活動，是由于優(yōu)先參與的CAR-T一個優(yōu)于一個，或者多靶點CAR-T同時給藥，無論不同靶點修飾的CAR-T能同時進(jìn)入或者分布相同,如何評價多靶標(biāo)CAR-T各自的療效。最后，與多靶點相關(guān)的問題的另一個顯著問題是成本問題。需要制備針對多靶標(biāo)的CAR-T不止一次的轉(zhuǎn)導(dǎo)，不止一次的制備過程都將是治療成本相當(dāng)昂貴。
CD19CAR-T治療已經(jīng)徹底改變了B細(xì)胞惡性腫瘤的治療方式，盡管在復(fù)發(fā)性，難治性患者身上取得了顯著的療效，然而久而久之的耐藥性依然存在，CD19轉(zhuǎn)陰是造成復(fù)發(fā)的主要原因?；蛐揎椩斐傻腃D19表達(dá)量下調(diào)，甚至完全丟失，或者剪切成其它形式，造成CD19CAR-T細(xì)胞的無法識別時有發(fā)生，其它由于細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)變，表觀修飾等造成的CD19轉(zhuǎn)陰都給CD19CAR-T治療帶來了極大挑戰(zhàn)。最新的研究報道稱一歷白血病患者治療過程中發(fā)生了病毒飄移，使得白血病細(xì)胞表面也表達(dá)CD19CAR,這就使得CD19CAR-T細(xì)胞束手無策，最終患者不治身亡。無論何種機(jī)制，單靶向CD19造成的選擇性壓力以及由此而來的腫瘤細(xì)胞克隆逃逸CD19CAR-T細(xì)胞的殺傷，最終導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)。多靶點CAR-T有可能解決抗原丟失造成的腫瘤細(xì)胞逃逸，起到更好的治療效果。目前多項臨床試驗如火如荼的進(jìn)行，療效如何我們拭目以待。
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