原創(chuàng) Eric 梅斯學(xué)術(shù) 2022-06-15 20:30 發(fā)表于英國
隨著非編碼RNA相關(guān)研究內(nèi)容的井噴，高分雜志對非編碼RNA研究的要求也水漲船高。今天就來向大解析外泌體介導(dǎo)的非編碼RNA參與疾病進(jìn)展的研究應(yīng)該如何開展。文章來自2022年3月份發(fā)表于Molecular Therapy雜志（11.454分）的“Exosome-derived circTRPS1 promotes malignant phenotype and CD8+ T cell exhaustion in bladder cancer microenvironments”,講述了在膀胱癌中外泌體來源的circTRPS1促進(jìn)細(xì)胞惡性表型及CD8陽性T細(xì)胞耗竭促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制。
膀胱癌 (BCa) 是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，但是其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不明確。外泌體在細(xì)胞間的通訊中發(fā)揮著重要的作用，可以包裹如circRNA, lncRNA, microRNA等多種遺傳物質(zhì)參與疾病進(jìn)展。本研究就從膀胱癌細(xì)胞分泌的circRNA TRPS1入手，系統(tǒng)地展開了癌細(xì)胞外泌體通過傳遞circRNA作用于微環(huán)境中的其他癌細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞的代謝重編程以及CD8陽性的T細(xì)胞耗竭，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。一般情況下，篩選差異表達(dá)的主要研究分子可以采用公共數(shù)據(jù)庫挖掘的方法，也可以使用自己收集的樣本進(jìn)行高通量的測序。在這篇文章中，作者選取4V4的膀胱癌病人樣本，通過高通量測序篩選了差異表達(dá)的circRNA基因，確定了研究的主角circTRPS1。隨后通過熒光原位雜交 (FISH) 在90對膀胱癌組織中驗(yàn)證了circTRPS1 在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)。單純的測序結(jié)果可能不一定準(zhǔn)確，因此在此處需要追加相關(guān)的驗(yàn)證。上述的生信分析和驗(yàn)證是確定了研究的主角分子。一般篩選做到上述內(nèi)容已經(jīng)比較完整，但是除此之外作者還發(fā)現(xiàn)circTRPS1 表達(dá)水平與膀胱癌患者總體存活率呈負(fù)相關(guān)。檢測了尿源性外泌體中不同膀胱癌臨床階段的circTRPS1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circTRPS1可以作為診斷膀胱癌進(jìn)展的臨床標(biāo)志物。這兩個部分的內(nèi)容為整體人體樣本的內(nèi)容增色不少。在明確主角分子后，作者在細(xì)胞水平開始了基因功能的研究。作者首先檢測了人正常尿路上皮細(xì)胞系 SV-HUC-1 和膀胱癌細(xì)胞系RT4、UM-UC-3、T24、5637 和 J82 中 circTRPS1 的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中circTRPS1表達(dá)是明顯升高的。這是與第一部分相對應(yīng)，在細(xì)胞層面驗(yàn)證circTRPS1的表達(dá)在膀胱癌進(jìn)展中表達(dá)是明顯升高的。隨后通過構(gòu)建si-NC和si-circTRPS1的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞，通過CCK8、EdU染色、流式檢測分析circTRPS1對膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。最后作者分離了正常尿路上皮細(xì)胞系SV-HUC-1 和膀胱癌細(xì)胞系RT4、UM-UC-3、T24、5637 和 J82的細(xì)胞培養(yǎng)基中的外泌體，同樣發(fā)現(xiàn)circTRPS1在膀胱癌細(xì)胞來源外泌體中是表達(dá)升高的。用敲減circTRPS1的UM-UC-3、T24細(xì)胞外泌體重新孵育UM-UC-3、T24細(xì)胞，可以降低細(xì)胞的增殖和侵襲。用過表達(dá)circTRPS1的5637細(xì)胞來源的外泌體，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與侵襲。在本部分實(shí)驗(yàn)中使用預(yù)轉(zhuǎn)染circRNA后分離的外泌體可以起到與單純轉(zhuǎn)染circRNA同樣的效果，這證明正是外泌體中包含的circRNA影響了相應(yīng)的細(xì)胞功能。（這一項(xiàng)對照實(shí)驗(yàn)在外泌體相關(guān)的研究中非常重要）。第三部分：circTRPS1下游的機(jī)制研究（經(jīng)典的海綿吸附機(jī)制，尋找下游microRNA）在此部分中，作者探究了circRNA的作用機(jī)制。首先作者通過生物信息學(xué)的方法篩選出了circTRPS1下游可能吸附的microRNA(包括miR-23a-3p、miR-23b-3p、miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-125a-5p 和miR-125b-5p)，隨后通過RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-141-3p和miR-200a-3p與circTRPS1的作用最為緊密。通過RNA pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) circTRPS1 與 miR-141-3p 的相互作用多于 miR-200a-3p。最后通過熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)確定miR-141-3p為最合適的靶基因。第四部分：circ TRPS1-miR-141-3p軸靶基因的確認(rèn)在此部分中作者進(jìn)一步探究了circTRPS1-miR-141-3p軸下游起到關(guān)鍵作用的靶基因。作者對腫瘤發(fā)生過程中的代謝重編程非常感興趣，所以使用了代謝組學(xué)來探究腫瘤的代謝變化，發(fā)現(xiàn)敲減circTRPS1 后膀胱癌細(xì)胞中的谷氨酰胺代謝、糖異生、谷氨酸代謝和脂肪酸氧化是主要的富集代謝途徑。隨后作者又進(jìn)行了RNA測序，發(fā)現(xiàn)GLS1基因在敲減circTRPS1后出現(xiàn)了顯著下降，且熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其與miR-141-3p的結(jié)合。GLS1是細(xì)胞谷氨酰胺代謝中的關(guān)鍵基因，因此被確定為靶基因。第五部分：靶基因GLS1的特色功能實(shí)驗(yàn)確定了膀胱癌進(jìn)程中的circTRPS1-miR-141-3p -GLS1軸后，作者根據(jù)靶基因GLS1的獨(dú)特功能，進(jìn)行了靶基因的特色功能實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞代謝等（主要見于附件圖）。此外作者還發(fā)現(xiàn)circTRPS1表達(dá)與CD8陽性的T細(xì)胞的數(shù)量有一定的相關(guān)性，因此在人體標(biāo)本中進(jìn)行了一些驗(yàn)證。第六部分：動物模型驗(yàn)證circTRPS1的功能在這部分中作者首先將轉(zhuǎn)染sh-NC和sh-circTRPS1 的T24細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)，觀察到T24-sh-circTRPS1的異種移植物腫瘤生長顯著降低，這表明 circTRPS1 促進(jìn)了體內(nèi)腫瘤的生長。隨后作者分離了sh-NC和sh-circTRPS1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后分離的外泌體，與此同時加用BPTES（靶基因GLS1的抑制劑） 注射小鼠，他們發(fā)現(xiàn)使用靶基因GLS1的抑制劑后，腫瘤大小較單純使用sh-circTRPS1外泌體注射的縮小顯著，這再次在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了circTRPS1-miR-141-3p -GLS1軸參與膀胱癌的進(jìn)展。這篇文章的套路并不是十分新穎，且工作量較一般的circRNA文章相對少一些，但是有很多的亮點(diǎn)值得我們學(xué)習(xí)和借鑒，尤其值得小白上手。外泌體是主要的亮點(diǎn)之一，做外泌體相關(guān)研究首先就是確定載體細(xì)胞和受體細(xì)胞是什么？本文中載體細(xì)胞和受體細(xì)胞都是膀胱癌細(xì)胞。但是在其他課題中可能就是實(shí)質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞了，這一點(diǎn)首先一定要明確。隨后要明確外泌體傳遞的是什么，可能是非編碼RNA（較多）也可能是蛋白質(zhì)，這一點(diǎn)也是要明確的。一般我們實(shí)際工作中都是采用測序來進(jìn)行篩選。明確了以上兩點(diǎn)之后，一個外泌體課題就可以轉(zhuǎn)化為一個普通的非編碼RNA課題了,套路也比較容易模仿了。此外一些技術(shù)性的問題，如電鏡檢測、外泌體分離、外泌體示蹤這些實(shí)驗(yàn)都有比較成熟的檢測機(jī)構(gòu)或商業(yè)試劑盒。最后本文除了外泌體之外也有很多亮點(diǎn)。比如本文工作非常工整，細(xì)胞、動物、人體三個維度均有涉及。尤其是在人體部分使用了大量的樣本，這是一般課題可能較難達(dá)到的。其次就是本文的靶基因做的是能量代謝方面，是一個較為新穎的切入點(diǎn)，也為本文增色不少。T細(xì)胞的耗竭也是一個不錯的方向，本文在這方面也取得了一定的結(jié)果。來源：https://www.cell.com/molecular-therapy-family/molecular-therapy/fulltext/S1525-0016(22)00022-3?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS1525001622000223%3Fshowall%3Dtrue
編輯：Catherine
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