NEJM醫(yī)學(xué)前沿 一類通過DNA編輯發(fā)揮作用的新型藥物 小程序 
2019年3月7日，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（NEJM）發(fā)表了題為《一類通過DNA編輯發(fā)揮作用的新型藥物》（A New Class of Medicines through DNA Editing）的綜述，介紹了基因編輯的發(fā)展，討論了將其作為治療手段療效、特異性、輸送和安全性對于所不可或缺的作用。我們在此簡介綜述中的主要內(nèi)容。閱讀全文翻譯，可以訪問《NEJM醫(yī)學(xué)前沿》官網(wǎng)、APP和微信小程序（點(diǎn)擊本文開頭圖片，即可直達(dá)小程序）。
1994年Jasin等發(fā)現(xiàn)，用核酸酶使靶基因中的DNA雙鏈斷裂，并且在斷裂的同時提供供體DNA模板，可以提高基因編輯的效率。這一發(fā)現(xiàn)表明可通過同源重組在突變位點(diǎn)插入新序列，同時還表明可通過稱為非同源末端連接（NHEJ）的過程在斷裂位點(diǎn)產(chǎn)生新突變。DNA中特定的雙鏈斷裂可誘導(dǎo)修復(fù)這一發(fā)現(xiàn)，奠定了基因組編輯領(lǐng)域的基本原理。圖1列出了基因組編輯技術(shù)及其商業(yè)應(yīng)用的發(fā)展時間線。
圖1. 基因組編輯的發(fā)展時間線（N Engl J Med 2019;380:947-59）
已經(jīng)用于基因編輯的核酸酶技術(shù)主要有歸巢核酸內(nèi)切酶-兆核酸酶、鋅指核酸酶（ZFN）、轉(zhuǎn)錄活化因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN）和與Cas9核酸內(nèi)切酶相關(guān)的成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR-Cas9），目前應(yīng)用較為廣泛的是TALEN和CRISPR-Cas9系統(tǒng)（圖2）。
現(xiàn)在大紅大紫的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)得益于科學(xué)家對細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的研究。由于基因組編輯中僅使用細(xì)菌系統(tǒng)的兩個成分，即Cas9核酸酶（最常用的Cas9酶來自產(chǎn)膿鏈球菌）和向?qū)NA（gRNA），因此稱該方法為Cas9-gRNA系統(tǒng)更為準(zhǔn)確。在基因組編輯中，gRNA與DNA靶位點(diǎn)結(jié)合后，Cas9核酸酶受誘導(dǎo)發(fā)生構(gòu)象變化，之后將DNA切割。gRNA序列的設(shè)計簡單方便，易于優(yōu)化與特定DNA靶位點(diǎn)的雜交，從而通過DNA堿基配對將Cas9-gRNA“引導(dǎo)”至其靶位點(diǎn)（圖2D）。
圖2. 基因組編輯的核酸酶平臺（N Engl J Med 2019; 380:947-59）
經(jīng)過核酸酶切割的DNA必須通過某種機(jī)制被細(xì)胞修復(fù)?；蚓庉嬌婕暗降男迯?fù)機(jī)制為非同源末端連接（NHEJ）和同源介導(dǎo)的雙鏈DNA修復(fù)（HDR），其具體過程和應(yīng)用見圖3。
圖3. 通過非同源末端連接（NHEJ）和同源介導(dǎo)的修復(fù)進(jìn)行的基因組編輯（N Engl J Med 2019;380:947-59）
圖A顯示通過NHEJ進(jìn)行的基因組編輯?；蚪M編輯可通過幾種方式利用DNA雙鏈斷裂修復(fù)的NHEJ機(jī)制。圖中描述的是NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯的三種主要方法，以及如何開發(fā)各方法用于治療特定疾病的例子。插入或缺失（indel）指在斷裂處非模板創(chuàng)建小的插入或缺失。圖B顯示通過同源介導(dǎo)的修復(fù)進(jìn)行的基因組編輯。在基因組編輯中，同源重組或單鏈模板修復(fù)可用于創(chuàng)建基因組的核苷酸特異性變化。圖中以示意圖形式顯示了具有單核苷酸精度，用于創(chuàng)建基因組變化的兩種方法的不同應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)高效編輯，必須在不激活細(xì)胞毒性反應(yīng)的情況下，將足量具有良好特異性的高活性核酸酶輸送入細(xì)胞核內(nèi)。對于具有完整的抵抗外源DNA和RNA的原代人細(xì)胞，必須以mRNA（進(jìn)入細(xì)胞后被翻譯）或核糖核蛋白復(fù)合物（例如Cas9-gRNA）的形式輸送核酸酶。新型的重組腺相關(guān)病毒載體可以在向細(xì)胞核輸送單鏈DNA時避免被細(xì)胞探測到。電穿孔是離體輸送這些分子的一種有效且相對無毒的方法。
一些靶向特定通路的小分子可以增強(qiáng)HDR介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)編輯。但是，某些干預(yù)措施干擾了細(xì)胞的正常修復(fù)方式或應(yīng)對雙鏈斷裂的方式，從而可能損害對在細(xì)胞周期中自然發(fā)生的20~40個雙鏈斷裂的修復(fù)能力。
輸送核酸酶過程中的其他方面也需要考慮。例如，雖然在將核酸酶輸送至原代人細(xì)胞方面，mRNA優(yōu)于質(zhì)粒DNA，但mRNA可誘發(fā)抗病毒Ⅰ型干擾素應(yīng)答。此外，核酸酶的長期表達(dá)或低特異性核酸酶的表達(dá)可激活p53通路，從而觸發(fā)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡。
在所有基因組編輯方法中，目前發(fā)展最成熟的是離體基因組編輯，即在體外對細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，然后將細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。近年，以中美兩國為代表的團(tuán)隊已經(jīng)開展了一些基因編輯的臨床試驗(yàn)（表1），例如：產(chǎn)生更強(qiáng)效的CAR T細(xì)胞，用于治療癌癥；敲除BCL11A的紅系特異性增強(qiáng)子，以上調(diào)自體紅系造血干細(xì)胞中的γ球蛋白，作為鐮狀細(xì)胞病和β-地中海貧血的潛在療法。臨床前研究提示，針對某些疾病（例如慢性肉芽腫病、X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷、X連鎖高IgM綜合征和HIV感染）的離體、自體、基于細(xì)胞的基因組編輯將取得較好療效。
表1. 基因組編輯臨床試驗(yàn)，2009-2019*（N Engl J Med 2019;380:947-59）
* 據(jù)ClinicalTrials.gov，目前有14項(xiàng)已結(jié)束或進(jìn)行中的ZFN試驗(yàn)，8項(xiàng)TALEN，以及12項(xiàng)CRISPR-Cas9。大多數(shù)有關(guān)ZFN的臨床前研究已經(jīng)發(fā)表并經(jīng)過同行評議。
雖然體外細(xì)胞編輯已經(jīng)取得了一定的療效，但是仍然存在很多局限性，比如尚無將經(jīng)過基因編輯的細(xì)胞移植到肝臟或腦的可靠方法。對于那些無法應(yīng)用體外編輯治療的疾病，體內(nèi)編輯，即將編輯裝置輸送到患者體內(nèi)從而在自然條件下對細(xì)胞進(jìn)行編輯，可能發(fā)揮重要作用。
但是人體自身免疫系統(tǒng)對體內(nèi)編輯是一個很大的障礙。所有主要核酸酶平臺均包含外源蛋白。因此，長期表達(dá)核酸酶可能誘發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。此外，首劑給藥可能導(dǎo)致患者對之后的給藥產(chǎn)生免疫力。Cas9-gRNA系統(tǒng)中使用的Cas9核酸酶來自兩種細(xì)菌（產(chǎn)膿鏈球菌和金黃色葡萄球菌）中的一種。由于每種細(xì)菌均在人群中有普遍感染，因此大部分成人之前就對Cas9有免疫力。
核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯會導(dǎo)致雙鏈斷裂，這是基因組不穩(wěn)定性的一個來源，而基因組不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致致癌性突變。縮短核酸酶的表達(dá)持續(xù)時間（例如以核糖核蛋白復(fù)合物的形式輸送Cas9-gRNA）、改變核酸酶的結(jié)合和催化活性可改善特異性。
評估基因組編輯安全性的一個關(guān)鍵問題是評估其準(zhǔn)確率或脫靶率，但目前尚無經(jīng)過驗(yàn)證的臨床前檢測方法?；蚪M內(nèi)持續(xù)發(fā)生自發(fā)隨機(jī)斷裂，而經(jīng)基因工程改造，能夠改變大量細(xì)胞的核酸酶可能會促進(jìn)在靶斷裂和其他部位自發(fā)隨機(jī)斷裂之間的易位?，F(xiàn)有檢測方法的靈敏度不足以檢測到這些事件的發(fā)生頻率，而且也無法評估DNA斷裂的功能性后果。另外，每個人的基因組在基線時就存在數(shù)百萬個微小差異，這使得難以評估核酸酶產(chǎn)生的潛在小變化的后果，使特異性評估進(jìn)一步復(fù)雜化。
雖然有不同方法（例如生物信息學(xué)、細(xì)胞捕獲和體外檢測）可識別哪些位點(diǎn)可能有脫靶插入或缺失，但每種方法均有其固有的偏差。使用動物模型預(yù)測基因工程安全性也不是預(yù)測臨床試驗(yàn)中安全性的有效方法。所以，目前的最佳方法是在仔細(xì)控制的1期臨床試驗(yàn)中評估基因編輯的安全性。
單基因疾病
基因編輯目前已經(jīng)能夠進(jìn)行高頻率的基因修正，因此理論上可以應(yīng)用于造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的數(shù)百種遺傳?。ㄈ珑牋罴?xì)胞病、X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷和X連鎖慢性肉芽腫?。?。雖然也可通過基因組編輯對其他器官系統(tǒng)的單基因疾病進(jìn)行基因“修復(fù)”，但仍存在分離、擴(kuò)增、移植組織特異性干細(xì)胞（用于離體治療）以及將基因組編輯工具輸送到患病組織內(nèi)等困難。
免疫腫瘤學(xué)
基因組編輯在臨床試驗(yàn)中已被用于改進(jìn)CAR T細(xì)胞療法。NHEJ介導(dǎo)的編輯可通過敲除TCRA（編碼TCRα）來去除T細(xì)胞的同種異體反應(yīng)性，也可通過敲除B2M（編碼β2-微球蛋白）來去除免疫原性，還可以移除抑制細(xì)胞功能的分子或者促進(jìn)細(xì)胞耗竭的分子，從而增加細(xì)胞的效力。HDR介導(dǎo)的編輯可確保將基因插入特定基因座內(nèi)。
再生醫(yī)學(xué)
迄今，細(xì)胞療法還未能利用細(xì)胞或干細(xì)胞替換或修復(fù)患病、受損或老化的組織?；蚪M編輯提供了改造細(xì)胞、增加細(xì)胞效力和安全性的方法，比如使細(xì)胞分泌預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的保護(hù)因子等。
合成生物學(xué)
合成生物學(xué)涉及通過基因工程改造細(xì)胞，使其獲得正常情況不具有的功能。目前可以對細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，以分泌治療性蛋白，以及利用細(xì)胞影響動物生理。將基因組編輯和合成生物學(xué)相結(jié)合的例子包括通過基因工程改造細(xì)胞，使其分泌促紅細(xì)胞生成素或傷口愈合生長因子。以后還有可能通過基因工程改造細(xì)胞，使其分裂、遷移、應(yīng)答、發(fā)出信號和分泌，從而對患病組織環(huán)境起到治療作用。
通過采用適當(dāng)?shù)谋O(jiān)管措施（目前并非所有的國家都有），在人體極早期發(fā)育中使用基因組編輯，可能讓我們在人類胚胎發(fā)育領(lǐng)域獲得重要且出乎意料的發(fā)現(xiàn)。這種研究應(yīng)該得到鼓勵，但我們不應(yīng)允許其應(yīng)用于提高人體的某項(xiàng)功能，例如例如使得健康人獲得與治療或預(yù)防嚴(yán)重疾病無關(guān)的性狀。人們普遍認(rèn)為，對人類基因組編輯的應(yīng)用持續(xù)進(jìn)行廣泛而透明的討論非常重要。
2018年11月被曝光的人類胚胎基因編輯事件，是不符合倫理、不負(fù)責(zé)任和不顧后果的，并且嚴(yán)重違反了關(guān)于基因組編輯應(yīng)用于人體胚胎的廣泛國際標(biāo)準(zhǔn)。制定可供引用的國際標(biāo)準(zhǔn)是目前的迫切需求，標(biāo)準(zhǔn)的出臺有利于阻止未來可能發(fā)生的更多的魯莽做法。
基因組編輯是一種變革性的產(chǎn)生藥物手段。但是作為一種新興的技術(shù)，我們還應(yīng)謹(jǐn)慎對待。目前，應(yīng)該首先考慮將其應(yīng)用于嚴(yán)重疾病，并且在應(yīng)用中關(guān)注更多細(xì)節(jié)問題。經(jīng)過不斷的改良和迭代，確認(rèn)其安全性及有效性后，才應(yīng)該考慮用于較輕微的疾病。
