骨關(guān)節(jié)炎的微環(huán)境以基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)過(guò)表達(dá)以及弱酸性為標(biāo)志，這使得開(kāi)發(fā)雙刺激響應(yīng)型臨床診斷納米探針用于骨關(guān)節(jié)炎的診斷和治療成為可能。然而，目前研制的MMP-13/pH感應(yīng)系統(tǒng)生物相容性差，降解性差，而且靶向性較差。廣西醫(yī)科大學(xué)的鄭立教授，俄克拉荷馬大學(xué)的毛傳斌教授以及廈門(mén)大學(xué)的劉剛教授合作設(shè)計(jì)了一種新型具有較好生物相容性的軟骨靶向和MMP-13/pH感應(yīng)性鐵蛋白納米探針 (CMFn)，該納米探針含有抗炎藥物(羥基氯喹，HCQ)，稱(chēng)為CMFn@HCQ，可用于骨關(guān)節(jié)炎的成像與治療。首先研究者們選取生物相容性，降解性以及pH調(diào)節(jié)性能都較好的鐵蛋白納米粒子（Fn）作為原材料，然后在Fn上通過(guò)基因方法標(biāo)記出一種特定的II型膠原(軟骨基質(zhì)的主要成分)靶向肽(WRYGRL)，從而生成一種軟骨靶向鐵蛋白(CFn)納米復(fù)合物。然后，研究者們用化學(xué)共軛的方法,將MMP-13的可切割的特殊肽底物與影像學(xué)染料結(jié)合，形成MMP-13敏感性鐵蛋白納米探針，最后在納米探針內(nèi)載入抗炎藥物羥氯喹（HCQ），生成CMFn@HCQ納米探針用于骨關(guān)節(jié)炎的治療（scheme 1）。Scheme 1. Schematic illustration of the CMFn@HCQ as a cartilage-targeting and MMP-13/pH dual-stimuli activatable theranostic nanoprobe for in vivo MMP-13 imaging and precision therapy of osteoarthritis.接著，研究者們通過(guò)透射電鏡（TEM）觀察了鐵蛋白納米探針的電鏡圖像，發(fā)現(xiàn)改性后的鐵蛋白納米粒子與原來(lái)的大小差別不大。并且光譜檢測(cè)特征峰發(fā)現(xiàn)有明顯的特征峰，證明材料合成成功。接著研究者們用MMP-13刺激這種納米探針，發(fā)現(xiàn)隨著刺激的持續(xù)，納米探針的熒光特性會(huì)逐漸升高，證明了納米探針具有良好的MMP-13感應(yīng)特性。研究者們還對(duì)其pH感應(yīng)性進(jìn)行了測(cè)試，通過(guò)不同pH值下測(cè)試藥物的釋放濃度，研究者們發(fā)現(xiàn)在pH等于5.0的時(shí)候藥物的釋放明顯優(yōu)于pH7.4的時(shí)候，證明了這種納米探針有較好的pH感性特性，在弱酸性的條件下具有較好的藥物釋放性能（Figure 1）。
Fig. 1. Characterization of the functionalized CMFn.然后，研究者們對(duì)這種納米探針的細(xì)胞相容性進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)CCK-8以及溶血實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這種探針具有較好的細(xì)胞相容性。隨后，研究者們又對(duì)其靶向性能進(jìn)行了探索，采用免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，加入MMP-13之后CMFn（紅色熒光）與帶陽(yáng)性染色的II型膠原（綠色熒光）重疊，表明CMFn成功靶向于軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的II型膠原，證明其具有較好的軟骨靶向性能。接著研究者們又對(duì)其成像性能進(jìn)行了測(cè)試，通過(guò)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，這種納米探針通過(guò)MMP-13刺激后產(chǎn)生的熒光具有較強(qiáng)的強(qiáng)度，具有良好的成像效應(yīng)（Figure 2）。
Fig. 2. In vitro cellular evaluation. 然后，研究者們對(duì)這種材料的抗炎性能進(jìn)行了測(cè)試，通過(guò)免疫熒光以及PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CMFn@HCQ材料組的MMP-13，IL-6，MMP-3，Col2a1等相關(guān)炎性表達(dá)顯著低于其他組，證明了這種材料可以較好的抑制骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)（Figure 3）。
Fig. 3. Inhibition of proinflammatory-cytokine–induced catabolism, as well as protection of the cartilage matrix from degradation by HCQ, MFn@HCQ or CMFn@ HCQ.在體外證明了這種材料的影像學(xué)和抗炎癥優(yōu)勢(shì)后，研究者們又進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)熒光成像觀察發(fā)現(xiàn)CMFn-OA組成像效果最佳，而且熒光強(qiáng)度隨著骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展強(qiáng)度逐漸升高。研究者們還用高效液相色譜法測(cè)定了體內(nèi)HCQ的濃度，發(fā)現(xiàn)材料組的關(guān)節(jié)內(nèi)藥物濃度較高，并且滯留時(shí)間較長(zhǎng)，由此表明這種材料具有較好的藥物釋放性能以及較好的成像性能。然后，研究者們將動(dòng)物體內(nèi)的骨關(guān)節(jié)提取出來(lái)，通過(guò)觀察關(guān)節(jié)面，發(fā)現(xiàn)CMFn-OA組的骨關(guān)節(jié)損傷較小，進(jìn)一步證明了這種載藥材料的抗骨關(guān)節(jié)損傷性能良好（Figure 4）。
Fig. 4. In vivo fluorescence images for detection of MMP-13 by CMFn probe after IA injection of papain to induce OA pathogenesis in C57BL6/J knees.最后研究者們還對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行了切片染色，結(jié)果表明通過(guò)CMF@HCQ治療后，組織的MMP-13表達(dá)明顯下降，并且骨關(guān)節(jié)炎評(píng)分（OARSI）明顯下降，證明這種材料在體內(nèi)具有良好的抗骨關(guān)節(jié)炎特性（Figure 5）。
Fig. 5. Histology, immunohistochemistry (IHC), and scoring of different OA treatments. 綜上所述，研究者們成功設(shè)計(jì)了一種新型的多功能納米復(fù)合探針，該探針兼具M(jìn)MP-13/pH雙敏感和軟骨靶向功能，具有良好的骨關(guān)節(jié)炎成像與抗骨關(guān)節(jié)炎作用，為骨關(guān)節(jié)炎的診斷和治療提出了一條新思路。本研究由廣西醫(yī)科大學(xué)鄭立教授，俄克拉荷馬大學(xué)毛傳斌教授以及廈門(mén)大學(xué)劉剛教授課題組合作完成，并于2019年9月24日在線發(fā)表于Biomaterials。論文信息：Haimin Chen, Zainen Qin, Jinmin Zhao, Yi He, En Ren, Ye Zhu, Gang Liu*, Chuanbin Mao*, Li Zheng*. Cartilage-targeting and dual MMP-13/pH responsive theranostic nanoprobes for osteoarthritis imaging and precision therapy. Biomaterials 2019，DOI: org/10.1016/j.biomaterials.2019.119520.
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