一、概述
在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側,細胞發(fā)生凋亡最早期,膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內側翻向外側,這一變化早于細胞皺縮、染色質濃縮、
DNA片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現(xiàn)象。
AnnexinV是一種磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。
碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一種
核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加,PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
因此,將Annexin V與PI聯(lián)合使用時,PI 則被排除在活細胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI 結合染色呈現(xiàn)雙陽性(Annexin V+/PI+)。
圖Annexin V 檢測
細胞凋亡原理
二、
試劑盒組份
產品名稱 規(guī)格
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I 100tests
產品組成成分:
Annexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E)
Annexin V-FITC (51-65874X)
Propidium Iodide Staining Solution(51-66211E)
三、實驗步驟
貼壁細胞需用0.25%的胰酶消化。注意過度消化可損傷細胞。在消化時可加2%的BSA可防止消化過度。如果用含
EDTA的胰酶消化時,注意必須徹底清除EDTA:在標記前用1×PBS或1×bindingbuffer洗滌,清除EDTA,以免殘余的EDTA與Ca2+螯合,影響Annexin V的結合。
(1)用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer;
(2)細胞收集。懸浮細胞收集:離心5分鐘;貼壁細胞:用不含EDTA的胰酶消化收集后(注:胰酶消化時間不宜過長,否則會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結合),于室溫2000rpm離心5~10分鐘,收集細胞;
(3)細胞洗滌:用預冷1×PBS(4℃)重懸細胞一次,2000rpm離心5~10分鐘,洗滌細胞;
(4)加入300μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞;
(5)Annexin V-FITC標記:加入5μL的Annexin V-FITC混勻后,避光,室溫孵育15分鐘;
(6)PI標記:上機前5分鐘再加入5μL的PI染色。
(7)上機前,補加200μL的1×Binding Buffer。
四、保存:
4℃保存;避免反復凍融。
五、注意事項
(1)本試劑只適用于實驗,不適用于臨床檢測;
(2)PI(propidium iodide,碘化丙錠)有毒性,能通過皮膚吸收,對眼睛有刺激作用,使用時需戴
手套;
(3)Annexin V-FITC和PI是光敏物質,在操作時請注意避光。在處理和標記時,盡可能在暗處進行。在孵育階段,用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細胞標記后,在暗室內用
顯微鏡觀察;
(4)整個操作過程動作要盡量輕柔,勿用力吹打細胞,盡量在4℃下操作,以免影響細胞狀態(tài)。
(5)在細胞洗滌的最后一步,請盡量將上清棄凈,以免PBS殘留,有可能會影響實驗結果。
(6)為防止熒光衰變,宜在1小時內進行流式檢測。
(7)PI染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高,建議首先進行Annexin V-FITC染色,最短可在上機前5分鐘再加入PI染色。、
其他Annexin V系列產品清單:
產品名稱 規(guī)格
ANXN V FITC APOPTOSIS DTEC KIT I 100tests
ANXN V PE APOPTOSIS DTEC KIT I 100tests
ANNEXIN V RECOM FITC 100tests
ANNEXIN V RECOM PE 100tests
ANNEXIN V RECOM FITC 200tests
ANNEXIN V RECOM PE 200tests
ANNEXIN V RECOM APC 25tests
ANNEXIN V RECOM APC 100tests
ANNEXIN V RECOM APC 200tests
ANNEXIN V RECOM Cy5 100tests
ANNEXIN V RECOM Biotin 100tests
ANNEXIN V RECOM Biotin 200tests
ANNEXIN V RECOM Cy5.5 100tests
ANNEXIN V RECOM V500 50tests
ANXN V-FITC FLUORESCENCE MICROSCOPY KIT 25tests
Propidium Iodide Staining Solution 2ml
7-AAD Staining Solution 2ml