實(shí)驗(yàn)概要
Annexin V是一種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試劑，本實(shí)驗(yàn)介紹了一個(gè)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法(Annexin V 法)。
實(shí)驗(yàn)原理
Annexin V是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的靈敏指標(biāo)之一。它是一種磷脂結(jié)合蛋白，可以與早期凋亡細(xì)胞的胞膜結(jié)合，而細(xì)胞質(zhì)膜的改變是細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)最早的改變之一。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，因而與細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合。由于在發(fā)生凋亡時(shí)，磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細(xì)胞核的改變，因此，與DNA碎片檢測(cè)比較，使用Annexin V可以更早地檢測(cè)到凋亡細(xì)胞。因?yàn)榧?xì)胞壞死時(shí)也會(huì)發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，所以Annexin V常與鑒定細(xì)胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，來區(qū)分凋亡細(xì)胞(Annexin V /核酸染料-)與死亡細(xì)胞(Annexin V /核酸染料 )。
主要試劑
1. PBS緩沖液：含0.1%NaN3，過濾后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer緩沖液(Cat. No. 66121E)：濃度為10×，使用時(shí)，用稀釋為1×濃度的應(yīng)用液。
3. Annexin V試劑與核酸染料：
Annexin V 核酸染料
Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或
Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X)
Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E)
Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)
主要設(shè)備
1. 一次性12×75mm Falcon試管。
2. 微量加樣器和加樣頭。
3. FACS流式細(xì)胞儀：上樣檢測(cè)。
4. CELLQuest軟件：獲取和分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
5. Annexin V檢測(cè)對(duì)照管：
Annexin V A-陰性對(duì)照 B-補(bǔ)償1 C-補(bǔ)償2
Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin和SAv-FITC PI和SAv-FITC
PE 未染色細(xì)胞 Annexin V-PE 7-AAD
FITC 未染色細(xì)胞 Annexin V-FITC PI
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取Falcon試管，按標(biāo)本順序編好陰性對(duì)照管和標(biāo)本管號(hào)。
2. 使用冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞兩次，再用1× Binding Buffer緩沖液制成1×106細(xì)胞/ml的懸液。
3. Falcon試管中加入100 μl細(xì)胞懸液。
4. 按以下體積加入Annexin V與核酸染料：
管號(hào) 名稱 熒光標(biāo)記Annexin V 核酸染料
1 陰性對(duì)照 - -
2 單陽1 AV-FITC -
3 單陽2 - PI
4 樣本 AV-FITC PI
5. 輕輕混勻，室溫(20°C ~25°C)避光處放置15分鐘。
6. *使用Annexin V-Biotin試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：
1×Binding Buffer緩沖液洗細(xì)胞一次，去上清。
1×Binding Buffer緩沖液100μl溶解SAv-FITC試劑0.5μg，加入到細(xì)胞管中。
輕輕混勻。
加入5μl PI，室溫(20-25°C)避光處放置15分鐘。
7. 各試驗(yàn)管中分別加入1×Binding Buffer緩沖液400μl。
8. 1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。
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