大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。今天跟大家介紹一下易基因的王牌技術(shù)：單細胞及微量樣本DNA甲基化測序(Micro DNA-BS)。
單細胞及微量樣本的DNA甲基化組學(xué)研究很大程度上受制于建庫技術(shù)。傳統(tǒng)的文庫構(gòu)建方法或類似于基因組DNA的單細胞擴增技術(shù)很難應(yīng)用到甲基化實驗過程中。易基因建立了一系列微量及單細胞甲基化檢測方法，可對于不同項目需求，個性化提供檢測方案，在全基因組、簡化基因組、靶基因等范圍開展甲基化檢測。
易基因建立的單細胞及微量樣本DNA甲基化測序技術(shù)包括：
單細胞全基因組甲基化測序（scWGBS）
單細胞簡化基因組甲基化測序（scXRBS）
微量樣本全基因組甲基化測序（Micro DNA-WGBS）
微量細胞或DNA簡化基因組甲基化測序（Micro DNA-XRBS）
應(yīng)用方向
單細胞及微量珍稀樣本的甲基化研究主要應(yīng)用于腫瘤發(fā)生機制，癌癥研究，胚胎植入前診斷，胚胎早期發(fā)育，生殖細胞重組，干細胞及細胞異質(zhì)性等研究領(lǐng)域。應(yīng)用的樣本包括單細胞、微量細胞、微量DNA等。特別適用于難以取得的珍稀樣本和細胞異質(zhì)性較大的組織樣本。
技術(shù)優(yōu)勢
1）微量細胞或單細胞全基因組甲基化測序（Micro DNA-WGBS）DNA起始量：
單細胞/100-1000個細胞；
1ng基因組DNA；
90%以上基因組CG覆蓋。
2）微量細胞或DNA簡化基因組甲基化測序（Micro DNA-XRBS）DNA起始量：
1ng基因組DNA；
10-20M有效CG位點覆蓋；
20G測序數(shù)據(jù)量。
技術(shù)路線
實驗策略
分析內(nèi)容
送樣要求
技術(shù)指標(biāo)
經(jīng)典案例
動物研究（項目文章）
微量細胞樣本Micro DNA-WGBS繪制猴子植入前胚胎發(fā)育中的DNA甲基化圖譜
Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.
背 景：
可能由于技術(shù)上的限制，還沒有研究揭示早期胚胎發(fā)育過程中的全基因組DNA再甲基化。
方 法：
利用具有超低DNA起始量（100個細胞）的微量細胞全基因組DNA甲基化測序技術(shù)（Micro DNA-WGBS）繪制靈長類動物（恒河猴，Macaca mulatta）植入前胚胎發(fā)育的全基因組甲基化圖譜。
結(jié)論：
本研究使用Micro DNA-WGBS對猴子早期胚胎發(fā)育過程的5mC進行單堿基分辨率、高覆蓋率的甲基化分析。分析結(jié)果鑒定了發(fā)育過程中的全基因組DNA去甲基化和從頭甲基化，特別是在從2細胞到8細胞階段的過渡期間，研究首次全面闡明了DNA甲基化動力學(xué)的“興衰”。此外，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶敲降實驗表明，異常的DNA甲基化會影響靈長類動物早期胚胎的正常發(fā)育。本研究結(jié)果進一步完善了目前關(guān)于哺乳動物DNA甲基化重編程的知識體系，并為未來靈長類動物胚胎發(fā)育的研究提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源。
人類研究
人類植入前胚胎發(fā)育的單細胞DNA甲基化組圖譜
Zhu, P., et al. (2018).Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos.Nat Genet 50(1)
背 景：
在哺乳動物基因組上，胞嘧啶（主要是CpG二連體中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下會發(fā)生甲基化。研究顯示，DNA甲基化對多個生物學(xué)過程都至關(guān)重要，如基因表達抑制、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)、X染色體的失活，以及基因組印記的維持等。此前研究顯示在著床前的早期胚胎發(fā)育過程中只有大規(guī)模的DNA去甲基化。而此次研究數(shù)據(jù)顯示，精子和卵細胞結(jié)合受精之后，在人類早期胚胎大規(guī)模DNA去甲基化的同時，也在大量高度特異的DNA從頭加甲基化，這表明在人類早期胚胎第一輪DNA甲基化組重編程過程中，全局的DNA去甲基化'凈結(jié)果’實際上是高度有序的大規(guī)模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化兩種分子過程相互拮抗產(chǎn)生的動態(tài)平衡的結(jié)果。
方 法：
利用單細胞DNA甲基化組高通量測序方法，首次在單細胞分辨率對人類植入前胚胎發(fā)育過程進行了更加深入的分析。
結(jié)論：
在這篇文章中，為了進一步在單細胞水平研究DNA甲基化重編程過程的動態(tài)特征，利用單細胞全基因組DNA甲基化組高通量測序技術(shù)，對人類植入前胚胎發(fā)育的各個關(guān)鍵階段進行了單細胞、單堿基分辨率的系統(tǒng)研究，主要發(fā)現(xiàn)有：
（1）首次發(fā)現(xiàn)了人類植入前胚胎發(fā)育過程中存在大量特異性的DNA從頭加甲基。
（2）首次發(fā)現(xiàn)從二細胞胚胎階段開始父母本基因組上的剩余甲基化水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)，在同一個單細胞中母本基因組上的剩余甲基化水平顯著高于父本基因組上的剩余甲基化水平。
（3）首次發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在早期胚胎卵裂過程中的不對稱分配可以用來追溯同一個胚胎中每個細胞的遺傳譜系。
參考文獻：
①Gao F, et al. De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.
②Zhu, P., et al. (2018).Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos.Nat Genet 50(1).
技術(shù)推介 | 染色質(zhì)免疫共沉淀測序 (ChIP-seq)
技術(shù)推介 | 全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序(WGBS)
