神經(jīng)退行性病癥（ND）為各種所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的異常削弱情況的總稱，幾乎所有形式的ND之間的一個(gè)共同點(diǎn)是嚴(yán)重缺乏可行的治療方案，現(xiàn)有療法的局限性導(dǎo)致大家對(duì)新型療法、基于設(shè)備的治療、物理治療和外科手術(shù)方案的更大興趣。
近幾十年來(lái)，基因組水平的治療形式引起了人們的極大興趣，新的CRISPR/Cas9基因編輯工具由于有效性、安全性和靈活性而不斷被探索。目前，CRISPR技術(shù)正在開發(fā)用于直接治療患者，相關(guān)臨床試驗(yàn)已經(jīng)在國(guó)內(nèi)開始進(jìn)行，并將很快在美國(guó)展開。大多數(shù)其它用于神經(jīng)變性疾病的基因療法已經(jīng)達(dá)到了早期臨床試驗(yàn)，但使用CRISPR技術(shù)來(lái)治療神經(jīng)退行性疾病仍處于早期臨床前階段。
CRISPR/Cas9已用于在神經(jīng)元內(nèi)進(jìn)行插入和缺失突變，從而在體內(nèi)中產(chǎn)生穩(wěn)定的基因敲除，這不僅展示了空間和時(shí)間上控制CNS中的基因表達(dá)的能力，還表現(xiàn)出對(duì)改善ND病理學(xué)中起關(guān)鍵作用的表觀遺傳方面的突破。
另外，在各種形式的治療遞送載體（例如合成納米顆粒和脂質(zhì)體載體）中，病毒通過(guò)在體內(nèi)擁有更高的基因傳遞性能，載體脫穎而出。而非病毒遞送工具在很大程度上被認(rèn)為不足以用于治療慢性神經(jīng)退行性疾病，因?yàn)樗鼈儍H限于對(duì)基因表達(dá)形成瞬時(shí)修飾的潛在影響。
病毒載體可確定基因編輯的組織特異性/細(xì)胞類型特異性以及具有通過(guò)腦脊液或血流局部進(jìn)入大腦的能力，使其成為在CNS中使用CRISPR/Cas9等遺傳工具的強(qiáng)有力的遞送技術(shù)，已在研究模型中表現(xiàn)出顯著的治療潛力。
為此，小編在下文重點(diǎn)介紹了聯(lián)合病毒載體與CRISPR/Cas9在治療神經(jīng)退行性疾病的最新進(jìn)展，其中涉及的兩種主要類型的載體是慢病毒載體和腺相關(guān)病毒（AAV）載體。
阿爾茲海默癥（AD）
阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病，臨床上表現(xiàn)為記憶和認(rèn)知功能障礙，語(yǔ)言和行為能力缺失，患者后期表現(xiàn)出嚴(yán)重的失憶癥和運(yùn)動(dòng)功能減弱，最終導(dǎo)致死亡。
β淀粉樣蛋白是大腦中淀粉樣斑塊的主要成分，而阿爾茲海默癥患者大腦中的淀粉樣斑塊積累能夠誘發(fā)患者腦細(xì)胞死亡。這也開啟了基因治療的有效策略，例如具有病毒載體的CRISPR/Cas9，以改變異常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而限制異常蛋白質(zhì)的積累。許多AD遺傳易感因素，如載脂蛋白E（APOE）和早老素（PSEN），已被歸類為AD發(fā)展的關(guān)鍵參與組分，也為CRISPR/Cas9系統(tǒng)開辟了潛在靶點(diǎn)。
今年4月，瑞典烏普薩拉大學(xué)的Martin Ingelsson及其同事發(fā)表了首例使用CRISPR/Cas9糾正患者細(xì)胞和小鼠淀粉樣蛋白前體蛋白的瑞典型突變（APPswe），治療早發(fā)性常染色體顯性遺傳AD（ADAD）。
他們敲除了突變的APPswe以減少患者細(xì)胞Aβ的產(chǎn)生，同時(shí)使野生型等位基因保持完整。使用相同的策略，他們還修改了攜帶人APPswe等位基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組，但尚不清楚是否會(huì)影響AD病理。該研究成果表明：早發(fā)性AD病例可能受益于APPswe的破壞。
此外，基于AD的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）疾病模型，哥本哈根大學(xué)與西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的兩項(xiàng)研究證明：利用CRISPR/Cas9糾正患者來(lái)源的iPSC中的PSEN1和PSEN2家族性突變，可以實(shí)現(xiàn)電生理學(xué)和β淀粉樣蛋白（Aβ）分泌的正?；?/p>
亨廷頓氏?。℉D）
亨廷頓氏?。℉untington's disease, HD）是一種遲發(fā)性神經(jīng)退行性遺傳病，患者的發(fā)病年齡一般為30～50歲，主要病因是亨廷頓基因（HTT）異常，從而造成代謝產(chǎn)物亨廷頓蛋白（Htt）異常。
這些異常蛋白質(zhì)積聚成塊，主要侵害基底節(jié)和大腦皮質(zhì)，具有高度的區(qū)域選擇性?；坠?jié)運(yùn)動(dòng)通路受損引發(fā)運(yùn)動(dòng)過(guò)度，即HD的主要臨床癥狀——舞蹈樣動(dòng)作；大腦皮層受損導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙，晚期多見癡呆。
HD的患病率在不同人群中變異很大，在美國(guó)，HD患病率為萬(wàn)分之一，患者需要接受全天候護(hù)理，生活質(zhì)量和壽命都被大大降低。最近研究顯示，中國(guó)/日本的HD患病率為100萬(wàn)分之4。目前，已有的療法都只能緩解HD的癥狀，還沒有一款改變HD進(jìn)程的療法獲得FDA的批準(zhǔn)。
與AD類似，HD中引起毒性的異常蛋白質(zhì)特征，開啟了使用CRISPR/Cas9與病毒載體修飾異常蛋白質(zhì)產(chǎn)生的類似策略。
去年1月，來(lái)自費(fèi)城兒童醫(yī)院的Monteys等人的一項(xiàng)研究，通過(guò)AAV1載體遞送單側(cè)核苷酸多態(tài)性（SNP）依賴的原型間隔區(qū)相鄰基序（PAM）靶向HTT外顯子-1的側(cè)翼，將Cas9蛋白連接至突變型HTT（mHTT）等位基因，同時(shí)避免影響正常的等位基因。結(jié)果表明，這種基于SNP指導(dǎo)機(jī)制的sgRNA/SpCas9復(fù)合物的遞送有效地將HD小鼠的HTT表達(dá)降低高達(dá)40％。
去年6月，埃默里大學(xué)（美國(guó)亞特蘭大）的一組研究表明，利用AAV病毒載體遞送CRISPR/Cas9介導(dǎo)的失活，誘導(dǎo)小鼠內(nèi)源性mHTT表達(dá)的永久性抑制。科學(xué)家們注意到，幾周后，亨廷頓小鼠模型原本聚集在腦內(nèi)的毒性蛋白質(zhì)幾乎完全消失了。更令人驚訝的是，盡管沒有達(dá)到對(duì)照小鼠的水平，但小鼠的運(yùn)動(dòng)能力的確有所改善。這為神經(jīng)退行性疾病的研究開辟了一條全新道路，研究人員表示希望能夠盡開展人體試驗(yàn)。
今年2月，來(lái)自波蘭生物有機(jī)化學(xué)研究所的研究人員在HD患者的細(xì)胞模型中測(cè)試了一種新的Cas9蛋白變體，該版本的Cas9能切割一條DNA鏈，而不是兩條DNA，這增加了Cas9可以編輯特定DNA序列的精確度。他們使用該版本的Cas9切除重復(fù)DNA序列，從而促使引起亨廷頓氏病的基因失活，并終止毒性蛋白質(zhì)的合成，并且沒有觀察到序列特異性的副作用。
肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）
肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）即為大家所知的漸凍人癥，也是導(dǎo)致霍金在輪椅上度過(guò)晚年的疾病。這是一種慢性進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化性疾病，占運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的80%，隨著疾病進(jìn)展患者會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的肌肉萎縮，癱瘓甚至因呼吸衰竭而死亡，一般無(wú)認(rèn)知、智能和感覺障礙。
在美國(guó)，ALS的患病率約為10萬(wàn)分之5，中國(guó)尚無(wú)確切的流行病學(xué)資料。ALS有家族性和散發(fā)性兩種類型，患者多為男性，多數(shù)患者發(fā)病年齡為50~70歲。
目前還沒有用于ALS根治性的藥物，它的致病機(jī)制尚不清楚。ALS屬于神經(jīng)退行性疾病，此類疾病都有一個(gè)共同特征——異常蛋白質(zhì)團(tuán)塊在大腦中積累。在ALS中，這些蛋白質(zhì)團(tuán)塊或聚合物被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)元具有致命毒性，最終導(dǎo)致毀滅性的疾病癥狀。
ALS的某些形式（約20％的遺傳形式）是由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突變引起的，這種基因通常有助于保護(hù)細(xì)胞免受有毒自由基的侵害，這為CRISPR/Cas9作為ALS的前瞻性治療手段取得了進(jìn)展。
強(qiáng)有力的概念證明是發(fā)表于2017年末的一項(xiàng)研究，來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的研究人員使用Cas9切除編碼SOD1蛋白的基因，并利用工程化的AAV載體穿透脊髓靶向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞核。
與未治療的大鼠相比，經(jīng)過(guò)治療的大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元保留率提高了約50％，疾病發(fā)作延遲了37％，生存機(jī)會(huì)增加了約25％，同時(shí)，突變SOD1蛋白的產(chǎn)生減少了2.5倍。目前，作者正在推進(jìn)工程化AAV的設(shè)計(jì)，以進(jìn)一步針對(duì)ALS模型中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元周圍的有害細(xì)胞。
另一項(xiàng)研究來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)，研究人員向SOD1基因突變的ALS小鼠肌肉注射編碼人類胰島素樣生長(zhǎng)因子1（hIGF1）的自身互補(bǔ)腺相關(guān)病毒載體9（scAAV9），結(jié)果發(fā)現(xiàn)scAAV9-hIGF1促使ALS小鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失的顯著減少以及ALS疾病發(fā)作的延遲，從而整體壽命延長(zhǎng)。
隨后，研究人員使用針對(duì)CNS的IGF1敲低的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果使D-氨基酸氧化酶（DAO）降低，D-氨基酸氧化酶控制D-絲氨酸水平，D-絲氨酸水平與ALS相關(guān)。這種形式的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因治療具有極高潛力，因?yàn)槟壳癋DA批準(zhǔn)的唯一一種ALS治療方法是利魯唑，據(jù)報(bào)道，利魯唑僅發(fā)揮適度的神經(jīng)保護(hù)作用，僅僅幾個(gè)月就能提高生存率。
病毒感染引起的神經(jīng)變性
除了一些我們熟知的神經(jīng)退行性疾病以外，最新的臨床前實(shí)驗(yàn)還顯示，CRISPR/Cas9的治療作用還延伸到改善由病毒感染引起的神經(jīng)變性。
丨約翰坎寧安病毒（JCV）
約翰坎寧安病毒（JCV）的致病作用被稱為進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病（PML），這是CNS中可能致命的脫髓鞘疾病。JCV作為DNA病毒的性質(zhì)使其可成為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要靶標(biāo)。
丨人類免疫缺陷病毒（HIV）
HIV感染導(dǎo)致免疫失調(diào)與自身免疫激活相結(jié)合，導(dǎo)致與腦病誘導(dǎo)相關(guān)的神經(jīng)認(rèn)知障礙，這種病毒引起的主要神經(jīng)系統(tǒng)疾病是NeuroAIDS。長(zhǎng)期感染艾滋病病毒已經(jīng)證明可以誘導(dǎo)顯著的神經(jīng)元丟失，并在一定程度上導(dǎo)致神經(jīng)變性。
由于HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能整合到宿主細(xì)胞基因組中，它可以作為一個(gè)持續(xù)的原始病毒庫(kù)來(lái)重新激活，導(dǎo)致該疾病通常是無(wú)法治愈的。但HIV的DNA前病毒復(fù)制中間體允許使用CRISPR/Cas9有效靶向系統(tǒng)，故在基因組水平上的根除策略具有治愈潛力。
丨單純皰疹病毒（HSV）
與HIV和JCV相比，靶向HSV缺乏成功的研究，而由于它是一種DNA病毒，很可能響應(yīng)于基于CRISPR/Cas9的基因治療。此外，研究表明HSV可能是阿爾茲海默癥的病因，這更加激發(fā)起了人們對(duì)此新型治療手段的興趣。
結(jié)語(yǔ)
CRISPR/Cas9基因編輯工具是基因治療和分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)強(qiáng)大的武器庫(kù)，應(yīng)該開展更多的研究，重點(diǎn)關(guān)注這種工具在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域提供的充足潛力。另外，病毒載體結(jié)合CRISPR/Cas9基因編輯提高了整體效率，為基因組水平的神經(jīng)疾病的治療提供了令人印象深刻的組合，而向臨床轉(zhuǎn)化前其安全性還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。
隨著病毒載體工程和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，這種結(jié)合形式的治療手段有望發(fā)揮強(qiáng)大的治療潛力。
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