你是否也常常為 RNA 提取感到困惑，每次提取都在不斷接受各種挑戰(zhàn)，例如 RNA 降解、低產(chǎn)率、低純度以及 DNA 污染等等。此外，還會(huì)遇到各種各樣的樣品，卻找不到一個(gè)普適的方法來(lái)解決。
今天，我們就給大家分享下 RNA 分離技巧，特別是最大限度地回收高質(zhì)量、無(wú) DNA 的 RNA 的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。
收集樣品后穩(wěn)定 RNA
RNA 是不穩(wěn)定的，極易降解。許多樣品含有高水平的 RNase，會(huì)快速降解 RNA。為了使之最小化，最好在采集時(shí)穩(wěn)定樣本中的 RNA。常用的樣品穩(wěn)定方法包括液氮快速冷凍、干冰乙醇浴或 -80 °C 冷凍室。然而，這些方法也有缺點(diǎn)，如核酸的凍融損傷。
最佳 RNA 穩(wěn)定方法：
在裂解緩沖液中立即溶解，使 RNase 失活 (如 TRIzol?、RNA 裂解緩沖液等)，然后樣品可以立即處理或冷凍保存；
浸泡在穩(wěn)定試劑中（如 DNA/RNA Shield），使核酸酶失活，并在環(huán)境溫度下長(zhǎng)時(shí)間保護(hù)核酸。適用于實(shí)地收集樣本或處理珍貴的病人樣本（例如組織活檢、全血等）。
確保樣品完全溶解
在 RNA 提取過(guò)程中，提高 RNA 產(chǎn)量和質(zhì)量的最佳方法是保證樣品完全裂解。然而，并不是所有的樣本都對(duì)相同的裂解方案敏感。例如，血細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、PBMCs 等）和微生物細(xì)胞往往很難有效溶解，僅僅添加基于洗滌劑的裂解緩沖液可能并不夠。
為了提高裂解效果，可以將裂解緩沖液與機(jī)械裂解步驟（研磨珠破碎）匹配，或者在裂解液上游加入酶裂解步驟（如蛋白酶 K、溶菌酶等）（圖 1）。
DNA 的存在會(huì)使基于 UV/VIS 的定量方法（如 Nanodrop）發(fā)生偏差，從而人為地提高 RNA 的定量，使其高于實(shí)際水平。
此外，在更敏感的下游應(yīng)用（例如 RNA-seq）中，它還可能導(dǎo)致錯(cuò)誤讀數(shù)。這可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)（例如 TRIzol? 相分離、DNA 去除柱和 DNase 處理）。
確認(rèn) DNA 的存在的最快方法是使 RNA 樣本可視化（如瓊脂糖凝膠，AgilentTapeStation? 等等）, 尋找 28S 核糖體 RNA 帶上方的任何高分子量片段（圖 2）。其他方法 , 如 qPCR 或 Qubit 也可以使用，如果您正在執(zhí)行對(duì) DNA 污染敏感的下游應(yīng)用，則更可取。
Zymo Research 開(kāi)發(fā)了一種新型的 RNA 提取試劑盒，該試劑盒具有新的緩沖液和離心柱體系，可以結(jié)合和提取 RNA，同時(shí)消除污染的 DNA。RNA 分離試劑盒包括用于柱上處理的 DNase I。
這消除了提取后 DNA 酶處理和清理步驟的需要，并簡(jiǎn)化了從提取到下游應(yīng)用的過(guò)程。下面的圖 3 說(shuō)明了基于 PCR 缺乏 DNA 擴(kuò)增，ZYMO 柱對(duì) Dnase 處理是有效的。
針對(duì)不同類型樣本推薦的 RNA 產(chǎn)品：
本方法無(wú)需傳統(tǒng) TRIZOL 提取方法的相分離，而且不需要使用任何有毒有害的試劑（例如氯仿），7 分鐘就可完成整個(gè)操作步驟并且可以提取到含 microRNA 的總 RNA。
本表格針對(duì)各種樣品列出了參考用量，詳細(xì)用量請(qǐng)參見(jiàn)說(shuō)明書
細(xì)胞樣品
組織樣品
液體樣品
添加等體積的 100% 無(wú)水乙醇到 TRIZOL 的裂解物中混合；
把混合物加到 ZYMO-SPIN IIC 柱上并且套在收集管里，離心，去除濾出液；
可以采用柱上消化的 DNA 的步驟去除 DNA（可選）；
添加 Direct-zol wash buffer 400 μL 到柱子上離心，去除濾出液；
添加 RNA wash buffer 700 μL 到柱子上離心，去除濾出液；
直接添加 50 μL of DNase/RNase-Free Water 到柱基質(zhì)上，下面套上一個(gè)干凈的 1.5 mL EP 管離心收集 RNA。
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