嘻嘻嘻~你們的小闊愛來(lái)啦~
一日不見如隔三秋，何況你的小闊愛還是一枚優(yōu)秀的技術(shù)支持~
每次都帶來(lái)驚喜~嗷~
本期帶來(lái)二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)比介紹~
前言
隨著人類基因組計(jì)劃的完成，測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展成熟，二代測(cè)序[也稱下一代測(cè)序（Next Generation Sequencing，NGS）] 越來(lái)越廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。NGS測(cè)序平臺(tái)經(jīng)歷了一系列收購(gòu)合并，目前測(cè)序平臺(tái)主要來(lái)源于三家公司： Illumina、Life Technologies和華大基因。所謂“工欲善其事，必先利其器”，想要做好腫瘤基因測(cè)序，必須先要“pick”好二代測(cè)序平臺(tái)！本文將圍繞上述三大主要的平臺(tái)展開對(duì)比介紹，讓我們一起了解一下到底誰(shuí)家測(cè)序平臺(tái)更適合您~
Illumina
1.1
基本原理
核心原理：邊合成邊測(cè)序（Sequencing By Synthesis，SBS）。主要流程：以雙端測(cè)序?yàn)槔饕―NA文庫(kù)構(gòu)建、流動(dòng)槽（FlowCell）吸附、橋式PCR、SBS和數(shù)據(jù)分析過(guò)程。
1.2
主要測(cè)序儀
Illumina二代測(cè)序平臺(tái)的核心原理為SBS。目前常用的測(cè)序儀有如下3款。
圖1-1 Illumina MiSeqDx[1]
MiSeqDx：是第一臺(tái)經(jīng)FDA批準(zhǔn)、適用于體外診斷（IVD）檢測(cè)的NGS平臺(tái)，并于2018年7月30日獲得NMPA認(rèn)證。
適用范圍：專為臨床實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，適用于靶向基因測(cè)序、靶向基因表達(dá)譜、小型全基因組測(cè)序、16S宏基因組、長(zhǎng)片段擴(kuò)增子測(cè)序等。并廣泛應(yīng)用于癌癥、液體活檢等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1][2]。
儀器特點(diǎn)：MiSeqDx的操作簡(jiǎn)便、體積??；靈活性強(qiáng)（不同通量的試劑可選，通量300MB~15GB）；可雙末端測(cè)序。但由于通量受限，MiSeqDx不適合用于全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing，WGS）和全外顯子組測(cè)序（Whole Exome Sequencing，WES）[1][2]。
Illumina NextSeq 500
NextSeq 500：是Illumina在2014年發(fā)布的一款高通量臺(tái)式測(cè)序儀，其測(cè)序原理為改良的雙通道邊合成邊測(cè)序（雙通道SBS）技術(shù)。
適用范圍：靶向序列測(cè)序、大/小型全基因組測(cè)序、外顯子組測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因表達(dá)譜、甲基化測(cè)序和16S宏基因組測(cè)序等。NextSeq 500同樣適合用于癌癥、液體活檢等科研實(shí)驗(yàn)[1][2]。
儀器特點(diǎn)：NextSeq芯片通量更加靈活（16.25GB~120GB），可根據(jù)數(shù)據(jù)量需求，選擇合適通量的芯片。并且雙通道SBS技術(shù)減少測(cè)序所需時(shí)間[1][2]。
Illumina MiniSeq
圖1-3 Illumina MiniSeq[1]
MiniSeq：是Illumina于2016年1月發(fā)布小型臺(tái)式測(cè)序儀，其體積比MiSeq小。該系統(tǒng)采用改良的雙通道邊合成邊測(cè)序技術(shù)原理。
適用范圍：靶向基因測(cè)序、靶向基因表達(dá)譜、小型基因全基因組測(cè)序、長(zhǎng)片段擴(kuò)增子測(cè)序、16S宏基因組測(cè)序等，可用于癌癥、液體活檢等科研實(shí)驗(yàn)[1][2]。
儀器特點(diǎn)：運(yùn)行時(shí)間短（7~24h）；操作簡(jiǎn)便且通量靈活性高（1.65GB~7.5GB），對(duì)于通量小醫(yī)療單位，不需要累積大量樣本再上機(jī)；但MiniSeq不適合WGS和WES。
1.3
技術(shù)特點(diǎn)
技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：
1. 通量靈活。
2. 簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化，減少手工操作引入的誤差及污染。
3. 利用可逆熒光標(biāo)記終止子，可在DNA鏈延伸的過(guò)程中檢測(cè)單個(gè)堿基摻入，并減少摻入的誤差；同時(shí)SBS確保了高質(zhì)量數(shù)據(jù)。
4. SBS策略解決由于相同堿基聚合導(dǎo)致測(cè)序不準(zhǔn)確問(wèn)題。
5. 錯(cuò)誤率可低至0.1%，主要錯(cuò)誤來(lái)源是堿基替換。
6. 可采用雙端測(cè)序技術(shù)。
技術(shù)缺點(diǎn)：
1. 測(cè)序讀長(zhǎng)短（目前二代測(cè)序平臺(tái)面臨的共同難題）。
Life Technologies
2.1
基本原理
Ion Torrent測(cè)序同樣采用SBS策略，與Illumina不同的是，其應(yīng)用半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)，主要基于當(dāng)dNTP結(jié)合時(shí)將釋放氫離子（H+）引發(fā)pH變化來(lái)獲取堿基信息進(jìn)行測(cè)序。主要步驟包括文庫(kù)構(gòu)建、乳液PCR、微珠富集、測(cè)序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析。
2.2
主要測(cè)序儀
Life Technologies測(cè)序的核心技術(shù)是利用半導(dǎo)體技術(shù)將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)堿基判讀。Life Technologies于2013年被Thermo Fisher Scientific收購(gòu)，目前常用的測(cè)序儀有如下幾款。
Ion Proton System
圖2-1 Ion Proton[3]
Ion Proton：是Life Technologies于2012年在中國(guó)推出的新臺(tái)式基因測(cè)序儀。其核心技術(shù)為離子半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)。
適用范圍：人類基因組、外顯子組或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[2][3]。
儀器特點(diǎn)：與Illumina和華大基因的測(cè)序平臺(tái)不一樣，Life Technologies的平臺(tái)無(wú)光學(xué)系統(tǒng)，其使用半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)，因此運(yùn)行速度快（2~4h）。
Ion S5和 Ion S5 XL
圖2-2 Ion S5和Ion S5 XL 系統(tǒng)[3]
注：A: Ion S5, B Ion S5 XL.
Ion S5和Ion S5 XL：是Thermo Fisher于2015年發(fā)布的兩款適用于靶向測(cè)序的二代測(cè)序儀。Ion S5 XL與Ion S5相比，增加了本地運(yùn)算，提升了數(shù)據(jù)分析速度。
適用范圍：適用于靶向RNA和DNA測(cè)序、微生物、轉(zhuǎn)錄組、外顯子組成。可用于癌癥、遺傳病等科研實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域[2][3]。
儀器特點(diǎn)：運(yùn)行速度快（2.5~4h）。與Ion Proton的單端讀長(zhǎng)（Single-end，SE）200bp相比，讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，可達(dá)SE400bp。
2.3
技術(shù)特點(diǎn)
技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：
1. 速度快，周期短。
2. 芯片通量靈活（0.3~0.5GB至10~15GB）。
技術(shù)缺點(diǎn)：
1. 只能做單端測(cè)序，單端測(cè)序最長(zhǎng)讀長(zhǎng)400bp。
2. 其技術(shù)原理導(dǎo)致測(cè)量單個(gè)堿基多次重復(fù)（如GGGGGG）可能出現(xiàn)誤差，這是限制該測(cè)序技術(shù)發(fā)展的主要原因[4]。
華大基因
3.1
基本原理
核心原理：邊連接邊測(cè)序（Sequencing By Ligation，SBL）。華大基因二代測(cè)序平臺(tái)（以BGISEQ-500為例）的五大關(guān)鍵技術(shù)流程：文庫(kù)構(gòu)建、DNA納米球（DNB）納米陣列組裝、聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（combinatorial probe-anchor ligation，cPAL）、多重置換擴(kuò)增的雙末端（Multiple Displacement Amplification-Pair End，MDA-PE）測(cè)序法和數(shù)據(jù)分析。
3.2
主要測(cè)序儀
華大基因的BGISEQ-1000雖然是國(guó)內(nèi)首個(gè)通過(guò)注冊(cè)的第二代基因檢測(cè)平臺(tái)，但BGISEQ-1000是一個(gè)大型平臺(tái)且難以小型化，對(duì)環(huán)境要求極苛刻，并不普遍適用于一般小型科研機(jī)構(gòu)或醫(yī)院。因此華大基因在2015和2016分別推出BGISEQ-500和BGISEQ-50，是目前常用的測(cè)序儀。
BGISEQ-500
圖3-1 BGISEQ-500 [5]
BGISEQ-500：是華大基因于2015年推出的新型桌面化測(cè)序系統(tǒng)，以cPAL及改進(jìn)的DNB為核心技術(shù)支撐。
適用范圍：靶向基因測(cè)序、腫瘤全外顯子組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等[2][5]。
儀器特點(diǎn)：配備雙芯片平臺(tái)（單芯片65~260GB/run；雙芯片130~520GB/run）；但其最長(zhǎng)讀長(zhǎng)只有 雙端100bp（Paired-end，PE）。
BGISEQ-50
BGISEQ-50：華大基因于2016年推出的自主研發(fā)高通量臺(tái)式測(cè)序系統(tǒng)，其延用BGISEQ-500的核心技術(shù)原理。
適用范圍：無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查NIPS、植入前胚胎染色體篩查PGS、未知病原體快速檢測(cè) PM-Seq、染色體異常檢測(cè) ChromoSeq[5]。
儀器特點(diǎn)：與BGISEQ-500相比，BGISEQ-50更小巧、環(huán)境適應(yīng)性更好,平均數(shù)據(jù)量更?。?.6~8GB/run）,解決了BGISEQ-500在樣本量少時(shí)浪費(fèi)芯片空間的問(wèn)題。但BGISEQ-50讀長(zhǎng)更短（SE50bp），不利于數(shù)據(jù)分析。
3.3
技術(shù)特點(diǎn)
技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：
DNB測(cè)序技術(shù)降低了試劑耗費(fèi)同時(shí)增加數(shù)據(jù)產(chǎn)出，提高測(cè)序準(zhǔn)確性。具有如下優(yōu)勢(shì)：
1. 增加待測(cè)DNA拷貝，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，從而提高準(zhǔn)確性。
2. 滾環(huán)擴(kuò)增中擴(kuò)增錯(cuò)誤不會(huì)累積。
3. 芯片上每個(gè)活化位點(diǎn)只固定一個(gè)DNB，保證信號(hào)間不會(huì)相互干擾。
4. 陣列化測(cè)序芯片結(jié)合DNB測(cè)序技術(shù)使成像系統(tǒng)像素和測(cè)序芯片面積得到最大利用。
技術(shù)缺點(diǎn)：
1. 華大基因的二代測(cè)序平臺(tái)的讀長(zhǎng)是三大平臺(tái)里面最短的，基因拼接可操作性差，這對(duì)數(shù)據(jù)分析影響大。
總結(jié)
如此看來(lái)，這三大二代測(cè)序平臺(tái)各有優(yōu)勢(shì)，先做一個(gè)簡(jiǎn)單的對(duì)比總結(jié)（表4-1）：
首先是Illumina：目前Illumina已在第二代測(cè)序市場(chǎng)中占主導(dǎo)地位[6]。無(wú)可否認(rèn)，由于其技術(shù)成熟，平臺(tái)穩(wěn)定多樣且平臺(tái)之間具有高度互補(bǔ)性與交叉性，使其在高通量測(cè)序市場(chǎng)上占很大優(yōu)勢(shì)。因此也越來(lái)越多研究實(shí)驗(yàn)選擇使用Illumina的NGS平臺(tái)[7]。缺點(diǎn)則是平均測(cè)序成本相對(duì)其他兩個(gè)平臺(tái)更高點(diǎn)。
然后是Life Technologies的測(cè)序平臺(tái)，其最具特色的是它們的技術(shù)原理——半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)。Ion Torrent是首個(gè)無(wú)需光學(xué)傳感系統(tǒng)的NGS平臺(tái)[8]，其將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化電信號(hào)，即通過(guò)合成堿基時(shí)釋放出的H+實(shí)現(xiàn)堿基的實(shí)時(shí)判讀，提升了測(cè)序速度。不過(guò)其對(duì)連續(xù)堿基的檢測(cè)還不夠完善，且測(cè)序準(zhǔn)確率較Illumina還是有所不及。
最后介紹的是華大基因。數(shù)據(jù)量大、平均測(cè)序成本低是其優(yōu)勢(shì)，適合做大型全基因組測(cè)序。但是要考慮樣本量有限時(shí)，芯片數(shù)據(jù)量浪費(fèi)的情況。除此以外，華大NGS平臺(tái)的讀長(zhǎng)較短（BGISEQ-500最長(zhǎng)讀長(zhǎng)PE100bp；BGISEQ-50最長(zhǎng)讀長(zhǎng)SE50bp），基因拼接可操作性較差，這影響了后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
如此分析下來(lái)，Illumina在二代測(cè)序市場(chǎng)中能一馬當(dāng)先就理所當(dāng)然了。但想要“pick”好適合自己的平臺(tái)最后還是要結(jié)合具體情況具體分析~
參考文獻(xiàn)
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