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擴(kuò)增子測(cè)序是一種高靶向性方法（對(duì)特定長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物或者捕獲的片段進(jìn)行測(cè)序），用于分析特定基因組區(qū)域中的基因變異。PCR產(chǎn)品（擴(kuò)增子）的超深度測(cè)序可以有效地識(shí)別變異并對(duì)其進(jìn)行特征分析?？傮w思路是靶向地捕獲目標(biāo)區(qū)域，然后進(jìn)行新一代測(cè)序(NGS)，分析測(cè)序結(jié)果，得到相應(yīng)信息。

根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將Hiseq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接 (Merge)成一條序列Tags，同時(shí)對(duì)Reads的質(zhì)量和Merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾。主要有如下3個(gè)步驟：

1) PE reads拼接：使用 FLASH v1.2.7軟件，通過(guò)overlap對(duì)每個(gè)樣品的 reads 進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags 數(shù)據(jù)(Raw Tags)；

2) Tags過(guò)濾：使用 Trimmomatic v0.33軟件，對(duì)拼接得到的 Raw Tags進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)(Clean Tags)；

3) 去除嵌合體：使用 UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù) (Effective Tags)。

OTU即分類操作單元，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系，種，屬，分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。

使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的 UCLUST對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得OTU，并基于Silva（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋。

圖1.各樣品OTU個(gè)數(shù)分布圖

將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平（phylum，class，order，family，genus，species）統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R語(yǔ)言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。

圖2.物種分布圖              圖3.物種豐度聚類熱圖

用QIIME軟件挑選出屬分類學(xué)水平上豐度最高的OTU的序列作為代表序列，進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，然后通過(guò)Python語(yǔ)言工具繪制圖形。

圖4.物種系統(tǒng)進(jìn)化樹

使用KRONA對(duì)物種注釋結(jié)果進(jìn)行可視化展示，展示結(jié)果中，圓圈從內(nèi)到外依次代表不同的分類級(jí)別，扇形的大小代表不同OTU注釋結(jié)果的相對(duì)比例。

圖5.KRONA示意圖

Alpha多樣性（Alpha diversity）反映的是單個(gè)樣品物種豐度（richness）及物種多樣性（diversity），有多種衡量指標(biāo)：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度（Community evenness）的影響。

使用Mothur （version v.1.30） 軟件，對(duì)樣品Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。一般為比較樣品間的多樣性指數(shù)，分析時(shí)會(huì)將樣品所含序列數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

稀釋性曲線(Rarefaction Curve)從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的序列，統(tǒng)計(jì)這些序列所代表的物種數(shù)目，并以序列數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線，用于驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。

圖6.稀釋性曲線圖

利用 Mothur 軟件和R語(yǔ)言工具依據(jù)各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的Shannon指數(shù)（反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)）繪制Shannon多樣性指數(shù)稀釋曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。Shannon index越大則OTU種類越多，物種越豐富，表明樣品中已涵蓋絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖7.Shannon Index曲線

使用QIIME軟件進(jìn)行 Beta 多樣性(Beta diversity)分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。Beta多樣性分析主要采用binary jaccard、bray curtis、weighted unifrac(限細(xì)菌)、 unweighted unifrac (限細(xì)菌)等4種算法計(jì)算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值?；谶@4種距離矩陣展開(kāi)的Beta多樣性分析，主要有以下幾點(diǎn)。

1）PCA與PCoA分析：通過(guò)一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序，選擇主要的前幾位特征值，采取降維的思想，找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo)，從而觀察個(gè)體或群體間的差異。

圖8.PCA分析圖

2）NMDS分析：將對(duì)象間的相似性或相異性數(shù)據(jù)看成點(diǎn)間距離的單調(diào)函數(shù)，在保持原始數(shù)據(jù)次序關(guān)系的基礎(chǔ)上，用新的相同次序的數(shù)據(jù)列替換原始數(shù)據(jù)進(jìn)行度量型多維尺度分析，用于比對(duì)樣本組之間的差異。

圖9.NMDS分析圖

3）UPGMA分析：基于各樣品序列間的進(jìn)化信息的差異來(lái)計(jì)算樣品間的差異，可以反映樣品在進(jìn)化樹中是否有顯著的微生物群落差異。

4）組間物種差異熱圖：基于OTU-Table和上述4種距離矩陣進(jìn)行物種聚類，從聚類中可以了解樣品之間的相似性以及各分類水平上的群落構(gòu)成相似性。 

圖10.UPGMA聚類樹

組間差異顯著性分析主要用于發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。

使用PICRUSt軟件通過(guò)比對(duì)16S測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

首先需要對(duì)生成的OTU-table進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（不同的種屬菌包含的16S拷貝數(shù)不相同）；然后，通過(guò)每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的greengene id，即可獲得OTU對(duì)應(yīng)的KEGG和COG家族信息，從而計(jì)算該KEGG和COG的豐度并從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的信息中獲得Pathway、EC信息、OTU豐度計(jì)算各功能類別的豐度。

圖11.組間KEGG代謝途徑差異分析圖

圖12.COG功能分類統(tǒng)計(jì)圖