cfDNA、ctDNA、MRD和ctDNA-MRD。
cfDNA（circulating cell-free DNA）即循環(huán)游離DNA片段，指的是存在于外周血液循環(huán)中但游離于細胞外的小片段DNA。人體本就存在正常數(shù)量的由體內(nèi)正常細胞死亡或直接分泌釋放出來的cfDNA，而在腫瘤、妊娠、器官移植等特定情況下，少數(shù)異源性cfDNA可作為基因檢測的標志物。cfDNA液體活檢中研究得最為深入的分支是ctDNA在腫瘤診療中的應(yīng)用。ctDNA（circulating tumor DNA）即循環(huán)腫瘤DNA片段，指的是由腫瘤細胞釋放到外周血液循環(huán)的小片段DNA。即使在一個典型腫瘤患者中ctDNA占總cfDNA的比例不到1%，目前的測序技術(shù)也已經(jīng)允許檢測其所攜帶的腫瘤基因組信息了。另外，與CTCs（循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells），指脫離于實體瘤并進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞）相比，ctDNA在腫瘤患者外周血中含量通常比CTCs高，因此針對腫瘤早篩或診斷，ctDNA檢測的靈敏度高于CTCs，但相應(yīng)地CTCs的準確性也優(yōu)于ctDNA。MRD可以是三個術(shù)語的縮寫，分別是分子殘留病灶（molecular residual disease）、可測量殘留病灶（measurable residual disease）和微小殘留病灶（minimal residual disease）。盡管更準確的翻譯可能應(yīng)該是可測量殘留病灶，但目前我們使用較多的是微小殘留病灶這一譯法。總的來講，MRD反映了腫瘤病灶的殘留狀況。經(jīng)過治療后，腫瘤患者體內(nèi)可能還會有少量的腫瘤細胞殘留，而這些腫瘤細胞數(shù)量可能少到不引起任何癥狀體征，通過細胞學(xué)鏡檢或血清學(xué)檢查等傳統(tǒng)手段通常無法檢測到，檢測需要借助靈敏度高的現(xiàn)代前沿技術(shù)如流式細胞術(shù)、PCR、NGS等。MRD即指這些標準細胞形態(tài)學(xué)分析無法檢測到的少量腫瘤細胞，如果患者MRD陽性，意味著殘余腫瘤細胞的量已足以被檢測到。那么，ctDNA-MRD又是什么呢？它與MRD經(jīng)常被混為一談，但二者并不等同。ctDNA-MRD是通過檢測ctDNA并使用某些算法推算出體內(nèi)MRD狀況的技術(shù)，因此它其實是基于ctDNA的MRD檢測技術(shù)，而MRD是一個狀態(tài)，一個難以直接觀察而需要借助其他手段檢測或通過其他標志物估計的實際狀態(tài)。幾個重要術(shù)語介紹完畢，下面我們講講MRD作為腫瘤標志物的來龍去脈，以及ctDNA-MRD在腫瘤診療中的應(yīng)用方向。對MRD的檢測可以追溯到40年前的血液腫瘤研究，如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。已有大量回顧性研究提示MRD是血液腫瘤復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)，MRD陽性意味著之前的抗腫瘤治療并未完全起效，MRD從不可檢測到可檢測的轉(zhuǎn)變或MRD增加與明顯的疾病復(fù)發(fā)有關(guān)。例如，AML（急性髓系白血?。┗颊呋熀筮M行造血干細胞移植前流式細胞術(shù)檢測到的MRD陽性與造血干細胞移植后復(fù)發(fā)獨立相關(guān)，而MRD陰性則與某些血液腫瘤更長的緩解期和可能的更長的生存率有關(guān)。目前，美國和歐洲一些兒科學(xué)研究已將誘導(dǎo)治療或鞏固治療后的MRD狀況作為危險度分層的依據(jù)，并以此指導(dǎo)加減治療。另外，在缺乏大樣本前瞻性研究結(jié)果的背景下，2021年美國FDA發(fā)布了在血液系統(tǒng)惡性腫瘤新藥開發(fā)中使用MRD作為替代療效反應(yīng)生物標志物的監(jiān)管文件，MRD在血液系統(tǒng)腫瘤診療中發(fā)揮的重要作用可見一斑。綜上，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤領(lǐng)域，MRD可能可以作為早期檢測復(fù)發(fā)的監(jiān)測生物標志物，MRD測試結(jié)果可能會為某些患者選擇緩解后治療提供信息，然而支持使用MRD作為預(yù)測性生物標志物的證據(jù)仍然有限，也就是目前還難以確定在治療前檢測MRD是否能預(yù)測治療效果從而指導(dǎo)治療的加減或開展與否，亦尚不清楚是否在MRD檢測陽性時提前干預(yù)而不是在明顯的疾病復(fù)發(fā)時進行干預(yù)就可以改善結(jié)局。隨著相關(guān)研究的開展，MRD與實體腫瘤的關(guān)系也越來越清晰，其中肺癌相關(guān)研究居多。對實體腫瘤患者而言，ctDNA檢測具有無創(chuàng)抽血的明顯優(yōu)勢，患者不必承擔(dān)活檢帶來的風(fēng)險，并且也允許了不同時間點的連續(xù)檢測。在早期篩查和早期干預(yù)、輔助治療、治療后復(fù)發(fā)監(jiān)測的過程中，ctDNA-MRD檢測能幫助進行早期診斷和風(fēng)險分層并提供指導(dǎo)治療的依據(jù)。復(fù)發(fā)預(yù)測 治療指導(dǎo) ctDNA可能在評估腫瘤負擔(dān)方面發(fā)揮作用，因為在多種癌癥類型中均已證明ctDNA水平與腫瘤大小相關(guān)，ctDNA檢測值隨腫瘤體積和期數(shù)遞增。同時，易于血漿取樣的優(yōu)點，使ctDNA水平得以被縱向連續(xù)跟蹤并得出腫瘤相關(guān)突變的狀態(tài)和趨勢，并經(jīng)常用以評估潛在的腫瘤復(fù)發(fā)。因此，在產(chǎn)生更顯著的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)之前，追蹤ctDNA水平可以為臨床醫(yī)生提供另一種評估腫瘤負擔(dān)和治療效果的工具。對于MRD指導(dǎo)輔助治療，一些研究表明，ctDNA可以用于檢測包括肺癌在內(nèi)的幾種實體腫瘤術(shù)后MRD的存在。而目前人們普遍接受的觀點是，MRD的檢測將幫助醫(yī)生識別出有可能從術(shù)后輔助治療中獲益的人群，使輔助治療的決策得以因人而異，因為雖然有些患者經(jīng)過輔助治療后能實現(xiàn)更長生存，但輔助治療對于另一部分患者可能是弊大于利的，這也是目前常規(guī)輔助治療的總體有效率如此之低的原因。在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，支持ctDNA-MRD檢測作為術(shù)后復(fù)發(fā)狀況評估的數(shù)據(jù)不斷積累。2017年ASCO年會的一份報告中，在12例可檢測到ctDNA的患者中，有11例發(fā)生了術(shù)后復(fù)發(fā)，相較而言，在132例ctDNA陰性的患者中僅有9例術(shù)后復(fù)發(fā)，該研究采用的是基于NGS的單核苷酸變異檢測。在2022 ASCO會上，DYNAMIC研究提示，ctDNA指導(dǎo)Ⅱ期結(jié)腸癌治療可減少一部分術(shù)后患者輔助化療的使用（相關(guān)鏈接：中腫陳功教授：希望與困境共存——談MRD檢測與結(jié)直腸癌新輔助化療）。在乳腺癌中也獲得了類似的結(jié)果。對于肺癌最終治療后的ctDNA檢測的預(yù)測預(yù)后價值研究，最初也有幾個有意思的病例。2014年，在CAPP-Seq（一項ctDNA檢測技術(shù)）的驗證研究中，有2例Ⅰb期NSCLC患者在術(shù)后輔助放療后3-4個月后ctDNA檢測結(jié)果為不可檢出，在治療后32個月和21個月他們也分別保持著臨床無疾病狀態(tài)。該報告還描述了一例Ⅱb期NSCLC患者，盡管該患者接受了放療并有殘留腫塊，但治療后未檢測到ctDNA。該患者在治療后22個月仍處于無疾病狀態(tài)，與ctDNA檢測結(jié)果一致，事后看來，該殘留腫塊應(yīng)該歸因于輻射引起的炎癥變化，與腫瘤無關(guān)。一些早期研究通過記錄術(shù)前和術(shù)后ctDNA水平的顯著差異，提示了ctDNA-MRD在肺癌領(lǐng)域發(fā)揮的作用。在一項針對41例NSCLC患者的研究中，在手術(shù)切除前后10天內(nèi)測量了6個常見腫瘤驅(qū)動基因的ctDNA突變頻率，前后對比發(fā)現(xiàn)突變頻率從中位數(shù)的8.88%下降到0.28%，最明顯的下降發(fā)生在Ⅰ期疾病患者中，其中有一例患者的ctDNA從可檢出下降到不可檢出。這些數(shù)據(jù)表明，ctDNA水平動態(tài)反映了現(xiàn)有的腫瘤負荷，且Ⅰ期肺癌經(jīng)過切除后MRD更有可能消失。另一項研究在76例接受根治性手術(shù)的早期NSCLC患者中報告了類似的結(jié)果，手術(shù)切除后，ctDNA突變頻率從7.94%±4.78%顯著下降到0.28%±0.32%。2017年Nature發(fā)表的TRACERx研究結(jié)果也表明ctDNA狀態(tài)與早期肺癌根治性手術(shù)后的疾病復(fù)發(fā)密切相關(guān)。該研究通過對每個患者的原發(fā)腫瘤進行外顯子組測序，為每個患者定制了單核苷酸變異的個性化panel（組套），然后使用ctDNA對患者進行縱向監(jiān)測，若血漿中存在兩個或多個預(yù)先確定的變異即判定為陽性結(jié)果。在隨訪期間（中位775天）14例發(fā)生復(fù)發(fā)的患者中，有13例患者在出現(xiàn)臨床明顯疾病之前先檢測出ctDNA陽性，且ctDNA檢測較影像學(xué)診斷中位提前了70天。相比之下，在未復(fù)發(fā)的10例患者中，只有1例出現(xiàn)了持續(xù)或復(fù)發(fā)的ctDNA陽性。上述研究的結(jié)果共同表明，ctDNA-MRD在腫瘤治療的臨床決策中有很強的潛在作用。而如果獲得距離術(shù)后更久的測量值，這些結(jié)果可能會更明顯。一項對50例NSCLC患者以及進行了骨科手術(shù)的健康對照組的分析顯示，術(shù)后血漿DNA（cfDNA）濃度出現(xiàn)的峰值可能歸因于組織創(chuàng)傷，而在3-6個月的隨訪中，除了2例NSCLC患者出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)外，其他研究對象的cfDNA水平均下降到了基線濃度。盡管ctDNA檢測在確定MRD方面有潛在的用途，ctDNA-MRD也極富前景，但目前多種問題限制了ctDNA-MRD在腫瘤診療作用的發(fā)揮。首先，ctDNA檢測的敏感度有待提高。ctDNA能早期檢測到MRD從而提前診斷腫瘤的復(fù)發(fā)，但是在早期腫瘤的檢出率上敏感度卻不高。據(jù)一項2014年的研究統(tǒng)計，僅50%的Ⅰ期肺癌被檢測到ctDNA，而這個比例在Ⅳ期肺癌是100%。在2014年另一項研究中，在多達82%的Ⅳ期肺癌患者中檢測到ctDNA，但僅在47%的Ⅰ期肺癌患者中檢測到ctDNA。據(jù)報道，在使用一種同時結(jié)合了ctDNA和蛋白質(zhì)生物標志物的檢測方法（CancerSEEK）篩查8種癌癥時，ctDNA和蛋白質(zhì)生物標志物的敏感度差異不大。其次，ctDNA檢測的特異性有待提高。cfDNA的存在導(dǎo)致存在來自多個來源的測序結(jié)果可能會使ctDNA測序的發(fā)現(xiàn)復(fù)雜化，并引入假陽性結(jié)果。此外，在上述TRACERx研究中，肺腺癌患者的預(yù)處理ctDNA檢出率僅為19%，而鱗癌患者為97%，對該結(jié)果如此大的差異，并沒有找到明確的原因。而且，盡管個性化panel的ctDNA檢測具有高度的預(yù)測性，但其價格昂貴，性價比仍有待考慮。最后，即使MRD確實是一個良好的腫瘤標志物，也還有很多技術(shù)問題和實際應(yīng)用問題需要解決。例如，對于流式細胞術(shù)、PCR、NGS都適用的患者，應(yīng)該使用哪一種進行MRD評估？MRD檢測水平在不同的機構(gòu)是否可重復(fù)？進行監(jiān)測時MRD應(yīng)該在哪幾個時間點進行評估？什么水平的MRD足以促使治療方法的改變？治療后MRD的減少是否一定預(yù)示了更好的無復(fù)發(fā)或總生存率？盡管人們對ctDNA檢測的敏感性和特異性等種種局限性存在擔(dān)憂，但目前的技術(shù)已經(jīng)極大改進了ctDNA檢測方法，各大臨床研究也正在不斷開展。在之后的系列文章中我們將繼續(xù)介紹ctDNA-MRD的前沿技術(shù)和循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，敬請期待。[1] Walter RB et al.. Measurable residual disease as a biomarker in acute myeloid leukemia: theoretical and practical considerations. Leukemia. 2021 Jun;35(6):1529-1538.[2] Estey EH. Acute myeloid leukemia: 2013 update on risk-stratification and management. Am J Hematol. 2013 Apr;88(4):318-27.[3] Berry DA et al.. Association of Minimal Residual Disease With Clinical Outcome in Pediatric and Adult Acute Lymphoblastic Leukemia: A Meta-analysis. JAMA Oncol. 2017 Jul 13;3(7):e170580.[4] Abbosh C, Birkbak NJ, Swanton C. Early stage NSCLC - challenges to implementing ctDNA-based screening and MRD detection. Nat Rev Clin Oncol. 2018 Sep;15(9):577-586.[5] Chae YK, Oh MS. Detection of Minimal Residual Disease Using ctDNA in Lung Cancer: Current Evidence and Future Directions. J Thorac Oncol. 2019 Jan;14(1):16-24.[6] Moding EJ et al.. Detecting Liquid Remnants of Solid Tumors: Circulating Tumor DNA Minimal Residual Disease. Cancer Discov. 2021 Dec 1;11(12):2968-2986.相關(guān)鏈接
中腫陳功教授：希望與困境共存——談MRD檢測與結(jié)直腸癌新輔助化療
作者：杜燕旋
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