氧氣是絕大多數(shù)高等生物所必需物質(zhì)，然而生命為適應(yīng)低氧環(huán)境而進(jìn)化出一個(gè)保守的低氧信號應(yīng)答機(jī)制，通過感知氧含量而啟動不同應(yīng)答。低氧信號機(jī)制的闡明一方面深化對多種生理現(xiàn)象的理解和認(rèn)識，另一方面也為相關(guān)疾病治療提供全新策略。
氧（oxygen，O）是地殼中含量最多的元素，基本以氧化物（含有氧的化合物）形式存在；而兩個(gè)氧原子構(gòu)成的氧分子（O2）則是大氣基本成分之一，對于地球上大多數(shù)生物尤其是高等生物而言具有必不可少的作用。然而，氧對生命而言具有雙刃劍作用，一方面不可或缺，因?yàn)榇蟛糠稚繒r(shí)每刻的能量代謝和其他生理過程都依賴氧的參與；另一方面氧還具有損傷作用，氧化過程產(chǎn)生的自由基等副產(chǎn)物是危害健康重要因素之一。因此，氧的感知和調(diào)控就成為科學(xué)家關(guān)注的重要問題。
氧的發(fā)現(xiàn)和作用
盡管氧在自然界已存在上億年，但真正被認(rèn)知并開始研究才僅二百多年歷史。十八世紀(jì)七十年代，英國化學(xué)家普里斯特利（Joseph Priestley）、瑞典化學(xué)家舍勒(Carl Wilhelm Scheele)以及法國化學(xué)家拉瓦錫（Antoine Laurent Lavoisier）幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)氧的存在，特別是拉瓦錫還對氧的作用進(jìn)行了科學(xué)闡述，提出燃燒本質(zhì)是物質(zhì)與氧的反應(yīng)，擯棄了當(dāng)時(shí)主流的“燃素說”，從而極大推動化學(xué)的快速發(fā)展。拉瓦錫還做出另一項(xiàng)重大貢獻(xiàn)，在嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上提出生物呼吸過程與物質(zhì)燃燒在本質(zhì)上類似，這一重要論斷標(biāo)志著生物氧化（早期也稱為生物燃燒）領(lǐng)域的誕生。
二十世紀(jì)，氧在生命過程中的作用和機(jī)制得到全面闡述。氧的歸宿就是生成氧化物，該過程又可分為兩種類型。一種是營養(yǎng)物質(zhì)（如葡萄糖、脂肪酸等）的氧化過程，該過程往往伴隨能量產(chǎn)生（包括ATP生成和熱量釋放），參與酶被稱為氧化酶（或還原酶）。另一類為非直接供能的物質(zhì)（如代謝廢物、毒物等）的加氧過程，該過程主要為增加物質(zhì)溶解性，進(jìn)而有利于排泄，參與酶稱為加氧酶，此外部分生物大分子（如DNA和蛋白質(zhì)等）也存在這一過程，其目的在于影響生物分子結(jié)構(gòu)和活性?？傊@些研究清晰表明氧對生命具有至關(guān)重要的意義。
紅細(xì)胞生成素和低氧誘導(dǎo)因子
氧的重要性意味著生命無法長期隔離氧氣，但機(jī)體在特殊情況（如高原環(huán)境和短時(shí)期窒息等）時(shí)會面臨氧供應(yīng)不足（低氧）狀況，如何適應(yīng)就成為生物體必須解決的重大問題。
二十世紀(jì)六十年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量會急劇增加，以增加對氧的攜帶和運(yùn)輸能力，從而達(dá)到緩解機(jī)體缺氧狀況。深入研究發(fā)現(xiàn)這是源于低氧可增加促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin, EPO）含量，EPO不僅成為第一個(gè)明確的低氧誘導(dǎo)分子，而且人重組EPO還被廣泛應(yīng)用于貧血等疾病的治療。
EPO的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用同時(shí)也提出一個(gè)基本科學(xué)問題，那就是EPO在低氧環(huán)境下的調(diào)控機(jī)制。1977年人EPO蛋白被純化成功，1985年人EPO基因也被成功克隆，這些進(jìn)展為進(jìn)一步機(jī)制研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。不久，美國約翰霍普金斯大學(xué)遺傳學(xué)家西門扎（Gregg L. Semenza）開始嘗試解決這一問題。
西門扎背景是兒科學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)，最初研究方向是地中海貧血的發(fā)病原因。西門扎在研究過程中無意間接觸到EPO，從而從根本上改變了研究方向。西門扎和同事將人的EPO基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，制備出的轉(zhuǎn)基因小鼠可生成更多紅細(xì)胞。這一結(jié)果說明人的EPO基因不僅可在小鼠體內(nèi)表達(dá)，而且還可發(fā)揮正常的從紅細(xì)胞生成功能。
在此基礎(chǔ)上，西門扎決定進(jìn)一步研究EPO的表達(dá)調(diào)控。1992年，西門扎和學(xué)生在EPO調(diào)控區(qū)（非編碼蛋白序列）鑒定出一段與低氧誘導(dǎo)相關(guān)的保守DNA序列，將這段序列連接到非低氧誘導(dǎo)基因后，可引起這些基因表達(dá)也受低氧調(diào)控，這一序列后被命名低氧應(yīng)答元件（hypoxia response element, HRE）[1]。西門扎推測由于HRE是一段DNA序列，因此理論上還存在對應(yīng)的特異因子，該因子可在細(xì)胞核內(nèi)與HRE結(jié)合并增加基因表達(dá)。為驗(yàn)證該假說，西門扎從低氧處理后的細(xì)胞核提取物中分離并純化得到一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可與HRE特異結(jié)合。特別是該蛋白質(zhì)只在低氧環(huán)境下穩(wěn)定存在，常氧時(shí)蛋白質(zhì)幾近消失，鑒于這種特性而將其命名為低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1, HIF-1）[2]。對HIF-1組成分析發(fā)現(xiàn)其含有兩種亞基，分別命名為HIF-1α和HIF-1β，其中HIF-1β與前期發(fā)現(xiàn)的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT) 相同，只有HIF-1α為新成分。在性質(zhì)方面，HIF-1α蛋白含量受氧的嚴(yán)格調(diào)控，只存在于低氧環(huán)境下下，而HIF-1β蛋白為組成型，其含量與氧的濃度無關(guān)。
西門扎隨后發(fā)現(xiàn)，機(jī)體大部分組織都存在穩(wěn)定的HIF-1α蛋白，然而EPO只在腎臟和肝臟中表達(dá)，這一事實(shí)表明HIF-1的作用應(yīng)不局限于EPO調(diào)節(jié)。在這一思路指導(dǎo)下，西門扎小組鑒定出多種HIF-1調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)基因，包括血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter-1,GLUT1）。
HIF-1發(fā)現(xiàn)的意義在于說明低氧感知是一個(gè)非常重要的生物學(xué)過程，具有廣泛的生物學(xué)意義，從而吸引更多研究人員加入對這個(gè)問題的研究之中，極大推動了該領(lǐng)域的快速發(fā)展。HIF的發(fā)現(xiàn)證明其對低氧應(yīng)答基因表達(dá)具有重要影響，然而仍有許多問題需要回答，首要問題是常氧環(huán)境下蛋白穩(wěn)定性降低原因。此時(shí)一項(xiàng)看起來毫無關(guān)聯(lián)的研究為此提供了重要線索。
VHL與低氧誘導(dǎo)因子
1904年，德國眼科醫(yī)生馮·希佩爾（Eugen von Hippel）首次描述了一種眼血管瘤；1927年，瑞典病理學(xué)家林道（Arvid Vilhelm Lindau）則獨(dú)立描述了一種小腦和脊髓血管瘤。后來發(fā)現(xiàn)，兩位研究人員描述的其實(shí)是同一疾病，因此從60年代開始將這種疾病統(tǒng)一命名為馮·希佩爾-林道疾?。╲on Hippel-Lindau (VHL) disease）。VHL是一種遺傳性疾病，患者發(fā)生血管瘤、血管母細(xì)胞瘤和腎癌等幾率極大增加，并且這些腫瘤血管化現(xiàn)象尤其明顯，體內(nèi)生成大量VEGF和EPO，這些特征預(yù)示著VHL可能與低氧有一定關(guān)聯(lián)。1993年，該病致病基因VHL被成功測序，發(fā)現(xiàn)其發(fā)生功能失活性突變，意味著VHL應(yīng)為一種抑癌基因，這一進(jìn)展為深入研究作用機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
美國分子生物學(xué)家凱林（William Kaelin）最初想法是成為一名臨床醫(yī)生，在約翰霍普金斯醫(yī)院完成實(shí)習(xí)和培訓(xùn)后進(jìn)入丹娜法伯癌癥研究院(Dana-Farber Cancer Institute)從事臨床腫瘤學(xué)研究。恰逢第一個(gè)抑癌基因RB鑒定成功，該基因突變可導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生，這一進(jìn)展掀起了抑癌基因的尋找熱潮，原本對基礎(chǔ)研究幾無興趣的凱林也逐漸改變看法，經(jīng)過一段時(shí)間實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)培訓(xùn)后于1992年開始自己的抑癌基因研究計(jì)劃，選擇對象是VHL突變相關(guān)的腎癌。
凱林決定研究VHL突變造成腎癌發(fā)生的機(jī)制。1996年，凱林與同事制備成功VHL突變細(xì)胞系，然后將其與VHL基因正常細(xì)胞進(jìn)行比較。他們意外發(fā)現(xiàn)，VHL突變細(xì)胞即使在常氧情況下仍可大量表達(dá)低氧誘導(dǎo)基因如VEGF等，當(dāng)為其轉(zhuǎn)入正常VHL基因后這種現(xiàn)象消失。凱林進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)VHL突變細(xì)胞之所以在常氧環(huán)境下表達(dá)低氧誘導(dǎo)基因是由于原本應(yīng)降解的HIF-1α卻可以正常存在[3]，這一結(jié)果說明VHL基因突變破壞了HIF-1α在常氧下的降解能力。
凱林的發(fā)現(xiàn)很好解釋了腎癌高度血管化的現(xiàn)象，然而提出一個(gè)新問題，即VHL蛋白在常氧環(huán)境下降解HIF-1α的機(jī)制。
VHL與泛素化
80年代末，英國牛津大學(xué)分子生物學(xué)家拉特克利夫（Sir Peter John Ratcliffe）也開始關(guān)注EPO表達(dá)調(diào)控機(jī)制，他專業(yè)背景為腎臟生理，而科研原動力來自于腎臟器官對氧的敏感性。拉特克利夫在90年代早期也發(fā)現(xiàn)了EPO中存在HRE，并對其調(diào)控作用進(jìn)行了初步研究。拉特克利夫還發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞移植入小鼠體內(nèi)成瘤后，在缺氧區(qū)出現(xiàn)大量低氧誘導(dǎo)基因如VEGF和GLUT1等，當(dāng)破壞HIF-1則使低氧誘導(dǎo)基因表達(dá)不在升高，并且腫瘤組織生長減緩。這些結(jié)果一方面證明了低氧信號通路廣泛的生物學(xué)作用，而且也與凱林腎癌的結(jié)果產(chǎn)生了密切聯(lián)系。
待HIF-1α和VHL先后發(fā)現(xiàn)后，拉特克利夫?qū)Χ咧g的興趣產(chǎn)生了濃厚興趣。由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解需要通過溶酶體途徑或蛋白酶體途徑，而HIF-1α的降解模式更像蛋白酶體，后續(xù)研究也證明這一推測，故此開始考慮VHL在蛋白質(zhì)泛素化過程中的作用。多項(xiàng)研究表明，VHL蛋白其實(shí)是泛素連接酶（E3）復(fù)合物的關(guān)鍵亞基，而拉特克利夫則進(jìn)一步證明VHL蛋白可與HIF-1α相互作用進(jìn)而在低氧環(huán)境下促進(jìn)其泛素化和降解[4]。多家實(shí)驗(yàn)室還在結(jié)構(gòu)層面證實(shí)了拉特克利夫的發(fā)現(xiàn)，確定了VHL催化的HIF-1α泛素化是造成常氧環(huán)境下HIF-1α蛋白穩(wěn)定性下降的主要原因。
拉特克利夫等的發(fā)現(xiàn)很好解釋了腎癌VHL基因突變后HIF-1α含量增加和低氧信號通路增強(qiáng)的問題，然而仍面臨一個(gè)亟待解決的重大問題，那就是細(xì)胞低氧感知和VHL啟動HIF-1α泛素化如何實(shí)現(xiàn)有機(jī)整合。
PHD與氧感知
靶蛋白進(jìn)行泛素化修飾前往往先進(jìn)行其他類型修飾以區(qū)分它與原蛋白差異，避免被錯(cuò)誤降解，最常見的修飾為磷酸化，然而凱林和拉特克利夫發(fā)現(xiàn)抑制蛋白磷酸化過程并不影響HIF-1α常氧下降解速率，而減少鐵離子或氧含量則顯著增加HIF-1α穩(wěn)定性，說明該修飾過程與鐵和氧相關(guān)。2011年，兩個(gè)小組采用類似策略，首先將泛素化途徑阻斷從而造成HIF-1α蛋白積累，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些積累HIF-1α的脯氨酸（proline）存在羥基化修飾，當(dāng)阻斷羥基化則破壞HIF-1α被VHL蛋白的識別和隨后的泛素化而使蛋白穩(wěn)定性增加[5,6]。不久，拉特克利夫和同事進(jìn)一步從果蠅中鑒定出一種雙加氧酶，其負(fù)責(zé)催化HIF-1α的羥基化[7]。哺乳動物也存在雙加氧酶，稱為脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白（prolyl hydroxylase domain, PHD），共包含3個(gè)成員，分別為PHD1、PHD2和PHD3。PHD酶活性受O2、Fe2+、維生素C和α-酮戊二酸等的影響，這一發(fā)現(xiàn)的意義在于為調(diào)控PHD酶活性提供重要思路。至此，低氧信號通路基本組分被鑒定完畢。
三位科學(xué)家和低氧信號
復(fù)雜的低氧信號通路
三位科學(xué)家的研究奠定了低氧信號通路基本框架，后續(xù)大量研究進(jìn)一步拓展了這一過程的詳細(xì)分子途徑。
首先，低氧信號通路存在更多中介分子。目前，在人類中共發(fā)現(xiàn)三種HIF-α，分別為HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，兩種HIF-β，分別為HIF-1β和HIF-2β，采用不同組合可形成多種異源二聚體，從而使低氧應(yīng)答機(jī)制更加豐富多樣化。除PHD受氧調(diào)節(jié)外，還鑒定出另一種羥基化酶FIH（factor inhibiting HIF,FIH），其催化的HIF-α羥基化并不影響HIF-α蛋白穩(wěn)定性，而是阻礙其與轉(zhuǎn)錄共激活蛋白結(jié)合，從而造成轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)降低。因此，常氧情況下HIF-α的兩種羥基化修飾可實(shí)現(xiàn)蛋白含量和轉(zhuǎn)錄活性雙重抑制，從而保證低氧誘導(dǎo)基因只能嚴(yán)格在低氧環(huán)境下表達(dá)[8]。此外，HIF復(fù)合物調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)時(shí)還常需要其他元件（作為轉(zhuǎn)錄共激活蛋白發(fā)揮活性）參與，著名的如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300，我們最近研究表明多種組蛋白去甲基化酶如JMJD1A和JMJD3等也參與了低氧信號通路，從而更加深化對低氧適應(yīng)機(jī)制的理解。
其次，低氧信號通路與其他信號通路存在復(fù)雜的互作，最著名的是mTOR信號通路。mTOR（mechanistic target of rapamycin）是一種蛋白激酶，可將環(huán)境脅迫信號如營養(yǎng)缺乏等于細(xì)胞內(nèi)蛋白合成、脂類合成等實(shí)現(xiàn)有機(jī)整合。低氧信號通路和mTOR信號通路通過協(xié)調(diào)作用而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞則惡劣生存環(huán)境下的適應(yīng)。
研究意義
低氧信號通路的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了一個(gè)全新研究領(lǐng)域，具有重要的理論價(jià)值和巨大的應(yīng)用潛力。低氧信號通路闡明了機(jī)體在不利環(huán)境下的適應(yīng)機(jī)制，包括低氧促進(jìn)紅細(xì)胞生成增多、耗氧量降低等代償性效應(yīng)以減少氧不足造成的機(jī)體損傷。低氧信號通路對一些組織氧化損傷和炎癥具有保護(hù)作用，如冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、傷口愈合、器官移植排斥和結(jié)腸炎等。然而過度低氧信號也可導(dǎo)致機(jī)體損傷，包括遺傳性紅細(xì)胞增多癥、慢性缺血性心肌病和阻塞性睡眠呼吸暫停等[9]。特別是大多數(shù)固體腫瘤都存在低氧信號通路異?；罨F(xiàn)象，并且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。低氧信號通路通過增加營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖攝取、血管生成等策略最終促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
低氧信號通路的關(guān)鍵元件還成為疾病治療重要靶點(diǎn)，從而為多種疾病治療提供新策略。PHD抑制劑可有效穩(wěn)定HIF-α蛋白穩(wěn)定性，進(jìn)而增加低氧靶基因表達(dá)，這一策略可應(yīng)用于治療貧血、缺氧引起的組織損傷等。抑制低氧信號通路則在癌癥治療方面顯示出巨大價(jià)值。以腎癌為例，腎癌是低氧效應(yīng)最明顯腫瘤，因?yàn)?em>VHL突變在腎癌中發(fā)生比例最高（達(dá)70%左右，其他腫瘤比例較低甚至缺乏），最早開發(fā)的VEGF抑制劑——貝伐單抗作用機(jī)制在于抑制血管形成以減降低癌細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)，而最近開發(fā)的特異性HIF-2α拮抗劑PT2399則在細(xì)胞、動物和臨床前實(shí)驗(yàn)中顯示出較好的治療效果[10]。
總之，低氧信號通路的闡明極大拓展了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究領(lǐng)域，其重要性也越來越多得到科學(xué)界的認(rèn)可，三位科學(xué)家西門扎、凱林和拉特克利夫因此于2016年分享美國有“小諾貝爾獎(jiǎng)”之稱的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)（Albert Lasker Award for Basic Medical Research），此外還分享2010年加拿大的蓋爾德納國際獎(jiǎng)（Gairdner International Award）等，隨著研究深入和臨床廣泛應(yīng)用，三位科學(xué)家也有望將來分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
[本項(xiàng)目由河北自然科學(xué)基金(No H2014205082)資助]
（E-mail：xiaoqiangguo123@163.com。）
[1] Semenza GL, Nejfelt MK, Chi SM, et al. Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer located 3' to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88(13):5680.
[2] Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem, 1995, 270(3): 1230.
[3] Iliopoulos O, Levy AP, Jiang C, et al. Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(20):10595.
[4] Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature, 1999, 399(6733):271.
[5] Ivan M, Kondo K, Yang H, et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2sensing.Science, 2001,292(5516):464.
[6] Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, et al. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science, 2001, 292(5516):468.
[7] Epstein AC, Gleadle JM, McNeill LA, et al. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell, 2001, 107(1):43.
[8] Hurst JH. William Kaelin, Peter Ratcliffe, and Gregg Semenza receive the 2016 Albert Lasker Basic Medical Research Award. J Clin Invest, 2016, 126(10):3628.
[9] Ratcliffe PJ. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J Physiol, 2013,591(8):2027.
[10] Ricketts CJ, Crooks DR, Linehan WM. Targeting HIF2α in Clear-Cell Renal Cell Carcinoma. Cancer Cell, 2016, 30(4):515.
