摘要：以葡萄糖為對(duì)照品, 采用硫酸-苯酚法測(cè)定不同產(chǎn)地中鐵皮石斛多糖含量。結(jié)果表明, 產(chǎn)地對(duì)石斛中多糖含量有明顯影響, 其中含量最高的為廣西容縣都嶠山 (14.95%), 最低的為廣西桂平白石山 (4.15%)。采用硫酸-苯酚法測(cè)定石斛多糖, 線性范圍為0.017~0.085 mg/mL, 加樣回收率為102.1%, RSD為3.67%。該方法簡(jiǎn)單可行、重現(xiàn)性好,建立石斛多糖含量測(cè)定方法, 可為石斛藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)、后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量控制提供指導(dǎo)。
關(guān)鍵詞：石斛; 多糖; 硫酸-苯酚法
在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，石斛被列為上品藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，藥用石斛的有效成分主要是生物堿和多糖，具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力、擴(kuò)張血管及抗血小板凝集等作用。由于石斛用藥的擴(kuò)大，需要大量的石斛原材料投入藥品的生產(chǎn)和研制。據(jù)全國(guó)中藥資源調(diào)查統(tǒng)計(jì)，石斛每年需求量為80萬(wàn)～100萬(wàn) kg，國(guó)內(nèi)外植物藥材市場(chǎng)對(duì)石斛的需求量每年約以20%的速度增長(zhǎng)，而野生資源的匱乏，今后只能依靠人工栽培來(lái)大量滿足市場(chǎng)需求。在國(guó)外，20世紀(jì)30年代就有日本學(xué)者對(duì)石斛鑒別進(jìn)行研究，但對(duì)石斛藥理研究、栽培加工生產(chǎn)大多還是集中在國(guó)內(nèi)。石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需優(yōu)化種質(zhì)資源。石斛屬植物品種多，由于引種栽培歷史較短，目前生產(chǎn)上栽培的石斛品種種質(zhì)混雜，通過(guò)對(duì)石斛品種資源收集、保存和鑒別，可為促進(jìn)人工栽培石斛提供優(yōu)質(zhì)的品種資源支持。為此，采集不同產(chǎn)地的石斛，進(jìn)行多糖含量的測(cè)定，為藥用石斛品種資源的鑒別、篩選提供依據(jù)，具有重要意義。
1.1 材料
石斛采集于全國(guó)各產(chǎn)地，經(jīng)廣西藥用植物園李力研究員鑒定均為正品，陰干，粉碎后備用。詳見表1。
表1 不同產(chǎn)地品種石斛藥材
序號(hào)產(chǎn)地藥材名稱1廣西西林縣鐵皮石斛2廣西桂平白石山鐵皮石斛3浙江溫州鐵皮石斛4廣西容縣都嶠山鐵皮石斛老條5廣西上林縣綠桿南山鐵皮石斛6廣西靖西縣樹上仿野生種植——南山鐵皮石斛7廣西大新縣紅桿南山鐵皮石斛
1.2 試驗(yàn)儀器及試劑
紫外分光光度計(jì)UV-2550：日本SHIMADZU；石油醚（餾程60 ℃～90 ℃，AR）、濃硫酸（98%，AR）、苯酚（AR）等：西隴化工股份有限公司。
2.1 供試液的制備
參照文獻(xiàn)[1-3]設(shè)計(jì)，精密稱取浙江鐵楓石斛藥材粉末50.55 g，加入石油醚500 mL回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾。藥渣揮干，加入80%乙醇500 mL回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾。藥渣揮干，加入1 000 mL蒸餾水煎煮3次，每次1 h。過(guò)濾得到水提取液，合并濃縮至約200 mL，得水提濃縮溶液（粗多糖提取液），轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，采用Sevag法除蛋白，加入50 mL氯仿-正丁醇混合溶液，振搖萃取，分取水層，同法操作數(shù)次，直至無(wú)乳白色沉淀出現(xiàn)為止。所得水層即為脫去蛋白的多糖溶液，抽濾，向50 mL濾液中加入乙醇至其濃度為80%，靜置過(guò)夜，抽濾，將所得沉淀用丙酮、乙醚、95%乙醇分別進(jìn)行洗滌，沉淀自然揮干，得到多糖2.672 2 g，置于干燥器中備用。
2.2 溶液的配制
2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
精密稱取葡萄糖對(duì)照品0.050 7 g，加蒸餾水溶解，定容于250 mL量瓶中，配成0.202 8 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。
2.2.2 樣品溶液的制備
稱取藥材粉末2 g，精密稱定得2.001 1 g，加入石油醚50 mL回流提取3次，每次2 h，過(guò)濾。藥渣揮干，加入80%乙醇40 mL回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾。藥渣揮干，加入60 mL蒸餾水于90 ℃保溫提取2 次，每次1 h，過(guò)濾，用熱蒸餾水反復(fù)洗藥渣并與過(guò)濾所得水提取液合并，采用Sevag法除蛋白后，定容至250 mL量瓶中，得樣品溶液。
2.2.3 測(cè)定方法
采用硫酸-苯酚顯色法測(cè)定，取多糖溶液1 mL，置于10 mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，將試管放入冷水浴中加入5.0 mL濃硫酸，于沸水浴中加熱10 min，于冰水浴中冷卻至室溫，放置20 min，在489 nm下測(cè)定吸光度。
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱取8.5 mg的葡萄糖對(duì)照品，置于100 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，得到0.085 mg/mL對(duì)照品溶液，吸取1，2，4，6，8和10 mL葡萄糖對(duì)照品溶液分別置于10 mL量瓶中，以蒸餾水定容，搖勻，得系列對(duì)照品溶液。精密吸取系列對(duì)照品溶液各1 mL，置于10 mL具塞試管中，均加入5%苯酚溶液1.0 mL，將試管放入冷水浴中加入5.0 mL濃硫酸，于沸水浴中加熱10 min，于冰水浴中冷卻至室溫，放置20 min，在489 nm下測(cè)定吸光度，另精密吸取1 mL蒸餾水，同法操作，作為空白參比。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，以系列對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程A=10.438 9C，相關(guān)系數(shù)r=0.993 0，線性范圍0.017～0.085 mg/mL。
2.3.2 換算因子的測(cè)定
取多糖100 mg，共3份，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加蒸餾水溶解，定容，搖勻，得多糖水溶液，精密吸取10 mL，置于50 mL量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，備用。精密吸取此液1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中葡萄糖濃度，按式（1）求出換算因子。
式中：W——稱取多糖的質(zhì)量，mg；C——葡萄糖濃度，mg/mL；D——稀釋倍數(shù)。
多糖的換算因子計(jì)算見表2。由此可得換算因子f=3.879 8，結(jié)果見表2。
表2 換算因子測(cè)定結(jié)果表
序號(hào)精制多糖2100.10.5160.0494.110 2 3101.10.5680.0543.744 4質(zhì)量/mg吸光度A供試液葡萄糖濃度/mg·mL-1換算因子f換算因子平均值1100.30.5550.0533.789 4 3.879 8
2.3.3 精密度試驗(yàn)
精密吸取1 mL樣品溶液（廣西桂平白石山）置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測(cè)定吸光度，重復(fù)取樣測(cè)定5次。精密度RSD計(jì)算結(jié)果為0.30%。
2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取樣品溶液（廣西桂平白石山）1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法，在0，20，40，60，80和100 min測(cè)定吸光度，考察樣品溶液在2 h內(nèi)的穩(wěn)定性。測(cè)定結(jié)果RSD值為1.39%。
2.3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取石斛藥材（廣西桂平白石山）粉末2 g，共5份，精密稱定，按照2.2.2的方法制備樣品溶液，精密量取樣品溶液1 mL置于10 mL具塞試管中，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量及RSD值，結(jié)果多糖含量為4.05%，RSD%為3.76%，重現(xiàn)性良好。
2.3.6 加樣回收試驗(yàn)
精密吸取5份已知多糖含量（1.13 mg/mL）的樣品溶液（廣西桂平白石山）30 mL置于50 mL量瓶中，分別加入葡萄糖對(duì)照品溶液10 mL，用蒸餾水定容，搖勻，從中精密吸取1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率及RSD值，結(jié)果見表3。
表3 加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果
編號(hào)質(zhì)量濃度/mg·mL-1回收率/%平均回收率%RSD/% 10.072 0103.5 20.071 9101.1 30.071 796.2 40.072 1106.0 50.072 0103.5 102.13.67
2.4 多糖含量的測(cè)定
按照2.2.2的方法制備樣品溶液，平行制備3份，各精密吸取1 mL置于10 mL具塞試管中，按照2.2.3的方法測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線折算樣品溶液中葡萄糖濃度，按式（2）計(jì)算多糖含量。
式中：C——樣品溶液中葡萄糖濃度，mg/mL；D——稀釋倍數(shù)；f——換算因子；W——樣品質(zhì)量，mg。
測(cè)定結(jié)果見表4。
表4 不同產(chǎn)地多糖含量的測(cè)定結(jié)果
序號(hào)產(chǎn)地藥材名稱多糖含量/% 1廣西西林縣鐵皮石斛6.30 2廣西桂平白石山鐵皮石斛4.15 3浙江溫州鐵皮石斛6.90 4廣西容縣都嶠山鐵皮石斛老條14.95 5廣西上林縣綠桿南山鐵皮石斛4.60 6廣西靖西縣樹上仿野生種植——南山鐵皮石斛5.32 7廣西大新縣紅桿南山鐵皮石斛8.81
試驗(yàn)以葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸法，通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地石斛中多糖含量，對(duì)多糖的提取及精制參考了文獻(xiàn)[1-3]的提取方法。從7批不同產(chǎn)地石斛中多糖含量測(cè)定結(jié)果可以看出，產(chǎn)地對(duì)藥材中多糖的含量有明顯影響，其中含量最高的為容縣都嶠山（14.95%），最低的為廣西桂平白石山（4.15%），測(cè)量?jī)x器為紫外分光光度計(jì)UV-2550，所測(cè)得的含量均高于最低檢測(cè)限。
鐵皮石斛含有的多糖具有較好的藥理作用，試驗(yàn)測(cè)定其中多糖的含量，對(duì)其質(zhì)量控制及進(jìn)一步產(chǎn)品生產(chǎn)具有參考意義，試驗(yàn)所采用方法簡(jiǎn)單可行、重現(xiàn)性好，建立了石斛多糖含量測(cè)定方法，可為石斛藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供指導(dǎo)。
參考文獻(xiàn)：
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Extraction and Content Determination of Polysaccharides from Dendrobium candidum in Different Areas
Dai Chuan-yong, Zhou Yuan, Li Tai-qiu, Luo Ying-ji*
Guangxi Vocational and Technical College of Agriculture (Nanning 530007)
Abstract：The glucose used as the reference substance, the polysaccharide content of Dendrobium candidum was determined by sulfuric acid-phenol method. Results showed that the origin had significant effect on the polysaccharide content of Dendrobium, the highest content was origin of Qiao Mountain Rongxian County (14.95%) and the lowest content was origin of Guangxi Guiping Baishi Mountain (4.15%). The sulfuric acid-phenol method for the determination of polysaccharides from Dendrobium candidum. The respectively average recoveries of polysaccharides were 102.1%, RSD=3.67% (n=5); The method is simple, feasible and reproducible. The method of determination of polysaccharide content of Dendrobium candidum was established, which could provide guidance for quality evaluation, follow-up product development and quality control of Dendrobium.
Keywords：Dendrobium; polysaccharide; sulfuric acid-phenol method
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