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在RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大家或多或少都會(huì)遇到擴(kuò)增曲線異常、熔解曲線異常、重復(fù)性差等問(wèn)題。小翊給大家整理了SYBR Green染料法的常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案，以供大家參考。

Part 1 擴(kuò)增曲線異常

正常的擴(kuò)增曲線一般呈S型，Ct值最好在20-30之間。異常的擴(kuò)增曲線包括Ct值偏大、無(wú)平臺(tái)期、平臺(tái)期下降等問(wèn)題。

1.Ct值偏大（如Ct值＞30）

1）模板量低或基因表達(dá)豐度低，建議增加模板量觀察Ct值能否成相應(yīng)倍數(shù)減少。

2）qPCR整個(gè)反應(yīng)條件不適宜或引物設(shè)計(jì)不當(dāng)導(dǎo)致擴(kuò)增效率低，建議通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)擴(kuò)增效率。

3）擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)長(zhǎng)，建議用三步法程序擴(kuò)增或優(yōu)化引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度最好不超過(guò)300bp。

4）體系中可能存在抑制劑影響酶的活性，建議梯度稀釋模板或重新制備純度更高的模板。

2.擴(kuò)增曲線無(wú)法達(dá)到平臺(tái)期

基因豐度低、循環(huán)數(shù)較少，建議增加循環(huán)數(shù)或選擇適合低豐度基因定量的產(chǎn)品。

3. 擴(kuò)增曲線平臺(tái)期下降

可能是基線范圍設(shè)置不當(dāng)，這種一般是由于模板量過(guò)高導(dǎo)致的。建議減小基線的終點(diǎn)值（一般建議設(shè)置為Ct值-4），調(diào)整后見(jiàn)下圖。

4.擴(kuò)增曲線平臺(tái)期鋸齒狀

1）RNA純度低，建議梯度加大模板稀釋倍數(shù)看優(yōu)化效果或重新制備高純度RNA重新實(shí)驗(yàn)。

2）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。

5.擴(kuò)增曲線雜亂無(wú)規(guī)律

可能是ROX濃度和機(jī)型不匹配，建議調(diào)整ROX濃度，調(diào)整后見(jiàn)下圖。

【注】可以在儀器上將參比染料設(shè)置由ROX更改為NONE，取消ROX的校正功能，查看擴(kuò)增曲線是否恢復(fù)正常，即可判定是否是ROX導(dǎo)致的。

6.有熔解曲線，無(wú)擴(kuò)增曲線

可能是擴(kuò)增程序設(shè)置錯(cuò)誤，未進(jìn)行熒光信號(hào)搜集，建議重新實(shí)驗(yàn)，增加擴(kuò)增程序中延伸階段熒光信號(hào)的搜集。

7.擴(kuò)增曲線有向上或向下的尖峰

可能是儀器故障，建議維修儀器。

8. 陰性對(duì)照有擴(kuò)增

1）NTC有擴(kuò)增，可能有以下兩種情況：

①Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃（一般正常qPCR產(chǎn)物，大小在100-300bp之間，熔解曲線Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚體導(dǎo)致，可進(jìn)一步優(yōu)化引物。

②有Ct值且＜35，表示反應(yīng)體系被污染，可逐步排除污染源。

2）NRC有擴(kuò)增

NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有g(shù)DNA污染。建議用DNase I消化或使用含有g(shù)DNA去除的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如Cat NO.11141ES）。

【注】NTC是指將H₂O代替模板的陰性對(duì)照反應(yīng)；NRC是指將未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板的陰性對(duì)照反應(yīng)。

9.復(fù)孔重復(fù)性差

1）加樣誤差導(dǎo)致，建議移液器定期校準(zhǔn)，另外可通過(guò)擴(kuò)大反應(yīng)體系或提前配制好預(yù)混液優(yōu)化。

2）模板量低，建議提高模板量，使Ct值落在15-30之間。

3）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。

Part2 熔解曲線異常

熔解曲線常用來(lái)判斷qPCR結(jié)果的特異性，理想的熔解曲線為單峰，異常的熔解曲線可能會(huì)出現(xiàn)雙峰、雜亂等情況，下面我們來(lái)逐一分析。

1.熔解曲線出現(xiàn)雙峰

1）雙峰，雜峰Tm在80℃之前

①可能存在引物二聚體，建議降低引物濃度或重新設(shè)計(jì)引物等方式優(yōu)化。

②可能是模板量過(guò)低，促使了引物二聚體的形成，建議提高模板量。

2）雙峰，雜峰Tm在80℃之后

①引物特異性過(guò)差導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，建議Blast檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。

②gDNA污染，可通過(guò)NRC進(jìn)行確認(rèn)。若NRC有Ct值，可重新制備模板。

2. 熔解曲線單峰但不尖銳

可能存在大小相近的非特異性產(chǎn)物，建議進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳確認(rèn)。

3.熔解曲線單峰但Tm值在80℃以前

推測(cè)未加模板，僅有引物二聚體的擴(kuò)增。進(jìn)行高分辨率瓊脂糖電泳確認(rèn)產(chǎn)物或重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

4.熔解曲線峰型雜亂

1）反應(yīng)體系污染，結(jié)合NTC和NRC結(jié)果確認(rèn)污染情況，建議從水，引物，酶和環(huán)境等逐一排除污染。

2）試劑暴露在強(qiáng)光或高溫下導(dǎo)致試劑失效，建議用新的試劑做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

3）儀器長(zhǎng)時(shí)間未校準(zhǔn)，建議定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。

4）耗材與儀器不匹配，需確認(rèn)對(duì)應(yīng)儀器對(duì)耗材的要求。

5.有擴(kuò)增曲線，無(wú)熔解曲線

可能是熔解程序設(shè)置錯(cuò)誤，未搜集熒光信號(hào)，建議重新實(shí)驗(yàn)，增加熔解曲線階段的信號(hào)搜集。

6.兩種試劑平行對(duì)比，同一產(chǎn)物Tm值不同

可能是不同試劑的促解鏈成分或含量不一樣，導(dǎo)致同一產(chǎn)物解鏈溫度Tm值不一樣。

7.熔解曲線前端起雜峰

可能是ROX濃度與機(jī)型不匹配，建議取消ROX校正查看熔解曲線是否正常，調(diào)整后如下圖。

【注】可以在儀器上將參比染料設(shè)置由ROX更改為NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲線是否恢復(fù)正常，即可判定是否是ROX導(dǎo)致的。

以上就是小翊為大家整理的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中可能遇到的問(wèn)題及相應(yīng)的建議，如果您還有其它問(wèn)題，歡迎留言咨詢~

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2.Han X., et al., Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq[J]. Cell. 2018 Feb 22;172(5):1091-1107.e17. （IF30.410）

3.Han F, Liu X, Chen C, et al. Hypercholesterolemia risk-associated GPR146 is an orphan G-protein coupled receptor that regμlates blood cholesterol levels in humans and mice[J]. Cell Research, 2020, 30(4): 363-365.（IF20.5）

4.Wang X, Ni L, Wan S, et al. Febrile temperature critically controls the differentiation and pathogenicity of T helper 17 cells[J]. Immunity, 2020, 52(2): 328-341. e

5.（IF21.522） 5.Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccination Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.（IF12.279）

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