在RT-qPCR的實驗過程中，大家或多或少都會遇到擴增曲線異常、熔解曲線異常、重復(fù)性差等問題。小翌之前給大家整理過SYBR Green染料法的常見問題及解決方案，近半年來，有不少小伙伴又陸續(xù)反饋了其它問題，這些問題您也可能碰到哦。在此，小翌將涉及到的問題再次進行歸納總理，快來收藏寶藏內(nèi)容吧，說不定什么時候就用到了呢~
正常的擴增曲線一般呈S型，Ct值最好在20-30之間。異常的擴增曲線包括Ct值偏大、無平臺期、平臺期下降等問題。1 模板量低或基因表達豐度低，建議增加模板量觀察Ct值能否成相應(yīng)倍數(shù)減少。
2 qPCR整個反應(yīng)條件不適宜或引物設(shè)計不當(dāng)導(dǎo)致擴增效率低，建議通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)擴增效率。3 擴增產(chǎn)物過長，建議用三步法程序擴增或優(yōu)化引物，擴增產(chǎn)物長度最好不超過300bp。4 體系中可能存在抑制劑影響酶的活性，建議梯度稀釋模板或重新制備純度更高的模板。5 八聯(lián)排管子或PCR板子與機型不匹配，建議挑選合適的耗材用于實驗。基因豐度低、循環(huán)數(shù)較少，建議增加循環(huán)數(shù)或選擇適合低豐度基因定量的產(chǎn)品。
可能是基線范圍設(shè)置太高，這種一般是由于模板量過高導(dǎo)致的。建議減小基線的終點值，可以設(shè)置為Ct值-4，調(diào)整后見下圖：
可能是基線設(shè)置不當(dāng)，建議增大基線的終點值，可以設(shè)置為Ct值-4，調(diào)整后如下：
可能是基線設(shè)置太高，建議減小基線的終點值，可以設(shè)置為Ct值-4，調(diào)整后如下：
可能是樣本不純，比如殘留的抑制物造成的，建議通過Nanodrop測定OD260/280檢測樣本的純度，也可以通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)樣本質(zhì)量，必要時重新制備樣本。
1 RNA純度低，建議梯度加大模板稀釋倍數(shù)看優(yōu)化效果或重新制備高純度RNA重新實驗。2 儀器長時間未校準(zhǔn)，建議定期進行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。可能是ROX濃度和機型不匹配，建議調(diào)整ROX濃度，調(diào)整后見下圖：
【注】可以在儀器上將參比染料設(shè)置由ROX更改為NONE，取消ROX的校正功能，查看擴增曲線是否恢復(fù)正常，即可判定是否是ROX導(dǎo)致的。
可能是擴增程序設(shè)置錯誤，未進行熒光信號搜集，建議重新實驗，增加擴增程序中延伸階段熒光信號的搜集。
1） Ct＞35，熔解曲線Tm值＜80℃（一般正常qPCR產(chǎn)物，大小在100-300bp之間，熔解曲線Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚體導(dǎo)致，可進一步優(yōu)化引物。2） 有Ct值且＜35，表示反應(yīng)體系被污染，可逐步排除污染源。NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有g(shù)DNA污染。建議用DNase I消化或使用含有g(shù)DNA去除的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（如Cat NO.11141ES）。【注】NTC是指將H2O代替模板的陰性對照反應(yīng)；NRC是指將未反轉(zhuǎn)錄的RNA作為模板的陰性對照反應(yīng)。
1 加樣誤差導(dǎo)致，建議移液器定期校準(zhǔn)，另外可通過擴大反應(yīng)體系或提前配制好預(yù)混液優(yōu)化。2 模板量低，建議提高模板量，使Ct值落在15-30之間。3 儀器長時間未校準(zhǔn)，建議定期進行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。熔解曲線常用來判斷qPCR結(jié)果的特異性，理想的熔解曲線為單峰，異常的熔解曲線可能會出現(xiàn)雙峰、雜亂等情況，下面我們來逐一分析。1） 可能存在引物二聚體，建議降低引物濃度或重新設(shè)計引物等方式優(yōu)化。2） 可能是模板量過低，促使了引物二聚體的形成，建議提高模板量。
1） 引物特異性過差導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增，建議Blast檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。2） gDNA污染，可通過NRC進行確認(rèn)。若NRC有Ct值，可重新制備模板。可能存在大小相近的非特異性產(chǎn)物，建議進行高分辨率瓊脂糖電泳確認(rèn)。
推測未加模板，僅有引物二聚體的擴增。進行高分辨率瓊脂糖電泳確認(rèn)產(chǎn)物或重復(fù)實驗。
1 反應(yīng)體系污染，結(jié)合NTC和NRC結(jié)果確認(rèn)污染情況，建議從水，引物，酶和環(huán)境等逐一排除污染。2 試劑暴露在強光或高溫下導(dǎo)致試劑失效，建議用新的試劑做對比實驗。3 儀器長時間未校準(zhǔn)，建議定期進行儀器校準(zhǔn)保養(yǎng)。4 耗材與儀器不匹配，需確認(rèn)對應(yīng)儀器對耗材的要求。可能是熔解程序設(shè)置錯誤，未搜集熒光信號，建議重新實驗，增加熔解曲線階段的信號搜集。
可能是不同試劑的促解鏈成分或含量不一樣，導(dǎo)致同一產(chǎn)物解鏈溫度Tm值不一樣。
可能是ROX濃度與機型不匹配，建議取消ROX校正查看熔解曲線是否正常，調(diào)整后如下圖：
【注】可以在儀器上將參比染料設(shè)置由ROX更改為NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲線是否恢復(fù)正常，即可判定是否是ROX導(dǎo)致的。
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