易基因｜疾病研究：DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征在高漿卵巢癌復(fù)發(fā)和耐藥過程中高度保守
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2022年07月27日，《J Exp Clin Cancer Res》雜志發(fā)表了題為“DNA methylation and transcriptomic features are preserved throughout disease recurrence and chemoresistance in high grade serous ovarian cancers”的研究論文，該研究通過全基因組DNA甲基化測序（WGBS）和對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析聯(lián)合揭示DNA甲基化和基因表達(dá)在原發(fā)性高級(jí)別漿液性卵巢癌（high grade serous ovarian cancer, HGSOC,高漿）的疾病進(jìn)展過程中是保守的。
標(biāo)題：DNA methylation and transcriptomic features are preserved throughout disease recurrence and chemoresistance in high grade serous ovarian cancers（DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征在高級(jí)別漿液性卵巢癌的整個(gè)疾病復(fù)發(fā)和耐藥過程中是保守的）
時(shí)間：2022.07.27
期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
影響因子：IF 12.658/1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：WGBS、RNA-seq
樣本實(shí)驗(yàn)：
對(duì)28例III/IV期HGSOC女性患者的62個(gè)新鮮冷凍匹配的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤組織樣本進(jìn)行全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），其中11例患者攜帶BRCA1和/或BRCA2突變。
摘要：
背景
目前對(duì)全基因組DNA甲基化在高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）復(fù)發(fā)和化療耐藥中的作用知之甚少。
方法
對(duì)28例III/IV期HGSOC患者的62個(gè)原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤組織樣本進(jìn)行了WGBS+RNA-seq測序分析。
結(jié)果
原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤的全基因組甲基化（平均每個(gè)腫瘤24.2M CpG）和轉(zhuǎn)錄組特征在不同患者之間表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性，但在同一患者的腫瘤中高度保守。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與BRCA1/2不突變腫瘤相比，BRCA1/2突變腫瘤中的差異甲基化區(qū)域（DMR）存在顯著差異（對(duì)照分析比較中分別為659個(gè)DMR和388個(gè)DMR）。表明BRCA1/2攜帶者的免疫通路過表達(dá)，提示免疫應(yīng)答增強(qiáng)有助于提高生存率（P=0.006）。
結(jié)論
本研究表明，即使經(jīng)過化療后，原發(fā)性腫瘤中的DNA甲基化和基因表達(dá)水平在整個(gè)疾病進(jìn)展過程中是保守的，且DNA甲基化和基因表達(dá)的變化不太可能成為HGSOC化療耐藥的驅(qū)動(dòng)因素。
結(jié)果圖形
（1）匹配的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）的全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和轉(zhuǎn)錄組對(duì)照分析
圖1：復(fù)發(fā)性高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的臨床特征
有和無BRCA1/2突變的女性原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤位置；
每位患者的病程。實(shí)心圓表示在本研究中描繪的腫瘤，空心圓表示收集但未描繪的腫瘤；
與非BRCA1/2突變腫瘤相比，攜帶BRCA1/2突變腫瘤的女性患者生存率提高；
用于分析的樣品選擇和QC過程。
（2）部分甲基化區(qū)域（PMD）的高變異性導(dǎo)致患者之間的腫瘤異質(zhì)性
圖2：高級(jí)別漿液性卵巢癌的全基因組甲基化異質(zhì)模式
原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤表現(xiàn)出全基因組甲基化的異質(zhì)模式，許多腫瘤在X染色體上表現(xiàn)出低甲基化（CpG值平均在10kB范圍內(nèi)，去除ENCODE'黑名單'區(qū)域）；
染色體1q42.13和22q13.33兩個(gè)區(qū)域示例，顯示兩個(gè)比較中的差異甲基化區(qū)域（方框區(qū)域）：原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤（左）、BRCA1/2突變攜帶者與BRCA1/2突變非攜帶者（右）。
圖3：高級(jí)別漿液性卵巢癌中部分甲基化區(qū)域（PMD）內(nèi)的高甲基化由soloWCGW驅(qū)動(dòng)
PMD-masking strategy說明。鑒定PMD后，在后續(xù)分析中mask這些基因組區(qū)域；
隊(duì)列中檢測到的大多數(shù)PMD為單腫瘤獨(dú)有，只有2%的PMD在30多個(gè)腫瘤中同時(shí)觀察到；
主成分（PCA）分析表明，腫瘤之間的大部分差異由PMD-soloWCGW位點(diǎn)甲基化導(dǎo)致。Mask基因組中常見的PMD和OVCAPMD可消除差異；
所有可能的腫瘤對(duì)的成對(duì)比較分析。Mask PMD后，PMD-soloWCGW差異與成對(duì)歐幾里德距離之間的強(qiáng)相關(guān)性消失
圖4：如部分甲基化區(qū)域（PMD）內(nèi)的基因表達(dá)所示，所有患者原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤的甲基化和轉(zhuǎn)錄水平基本保守
與PMD外的基因相比，多個(gè)腫瘤標(biāo)本共有PMD內(nèi)的基因低表達(dá)（左），但表達(dá)變化較大（右）；
癌癥中的絕大多數(shù)腫瘤抑制基因和形成（《癌癥基因組圖譜》定義的卵巢癌分子亞型的基因位于PMD外）；
匹配對(duì)照的RNA-seq顯示甲基化（上）和基因表達(dá)（下）中患者內(nèi)成對(duì)歐幾里得距離顯著小于患者間距離或階段內(nèi)距離。
（3）低甲基化增加免疫相關(guān)基因表達(dá)，并鑒定BRCA1/2突變HGSOC疾病復(fù)發(fā)的潛在驅(qū)動(dòng)因素
圖5：BRCA1/2突變腫瘤甲基化和表達(dá)水平的顯著差異
BRCA1/2突變腫瘤中鑒定出135個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMR），而BRCA1/2非攜帶者腫瘤中有高甲基化趨勢；BRCA1/2非攜帶者腫瘤中有101個(gè)區(qū)域高甲基化，而BRCA1/2突變腫瘤中只有34個(gè)區(qū)域高甲基化；
PMD mask后的全基因組CpG甲基化水平的主成分分析顯示BRCA1/2突變狀態(tài)的腫瘤差異趨勢；
基因表達(dá)數(shù)據(jù)的主成分分析顯示BRCA1/2突變狀態(tài)的腫瘤聚類趨勢；
比較BRCA1/2突變與不突變腫瘤差異表達(dá)基因火山圖。橙色表示BRCA1/2基因突變腫瘤中顯著上調(diào)基因（Padj<0.05），紫色表示顯著下調(diào)的基因；
BRCA1/2突變與不突變腫瘤的上調(diào)（橙色）和下調(diào)（紫色）差異表達(dá)基因的KEGG基因集富集分析；
BRCA1/2不突變腫瘤高甲基化區(qū)域的甲基化水平與基因表達(dá)相關(guān)的單個(gè)基因NAGLU、CDK2AP1、FGF18（P<0.005)。
結(jié)論：
本研究通過全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）對(duì)原發(fā)性和化療后耐藥復(fù)發(fā)的HGSOC進(jìn)行全面的DNA甲基化水平綜合分析，并對(duì)有無BRCA1/BRCA2突變的腫瘤進(jìn)行首次此類比較。與單細(xì)胞分析一致，本研究發(fā)現(xiàn)不同HGSOC患者之間存在分子異質(zhì)性，并為這種異質(zhì)性擴(kuò)展到化療耐藥、復(fù)發(fā)性疾病提供了證據(jù)。它們沒有共同的甲基化特征或特定的甲基化生物標(biāo)志物，表明與疾病復(fù)發(fā)或化療耐藥相關(guān)的共同機(jī)制和潛在生物學(xué)，并通過轉(zhuǎn)錄組分析在相同的原發(fā)性復(fù)發(fā)組織標(biāo)本中對(duì)該結(jié)果進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。數(shù)據(jù)表明在一線化療后耐藥和復(fù)發(fā)性腫瘤中的甲基化和轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化可能已經(jīng)存在于原發(fā)性腫瘤中，并不由化療而誘導(dǎo)。在比較有或無BRCA1/BRCA2突變的原發(fā)性腫瘤時(shí)，觀察到顯著的甲基化和/或轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征變化。BRCA1或BRCA2突變患者的生存期和無疾病進(jìn)展生存期的改善歸因于對(duì)鉑類化學(xué)藥物治療的反應(yīng)改善，本研究發(fā)現(xiàn)比較組之間的甲基化和轉(zhuǎn)錄組差異可能導(dǎo)致這些差異。
關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術(shù)
全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個(gè)胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時(shí)空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持，能廣泛應(yīng)用在個(gè)體發(fā)育、衰老和疾病等生命過程的機(jī)制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法。
易基因提供的全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進(jìn)而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏。
應(yīng)用方向：
WGBS廣泛用于各種物種，要求全基因組掃描（不錯(cuò)過關(guān)鍵位點(diǎn)）
全基因組甲基化圖譜課題
標(biāo)志物篩選課題
小規(guī)模研究課題
技術(shù)優(yōu)勢：
應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；
全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息，精確繪制甲基化圖譜；
單堿基分辨率：可精確分析每一個(gè)C堿基的甲基化狀態(tài)。
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術(shù)詳情了解請致電易基因。
參考文獻(xiàn)：
Gull N, Jones MR, Peng PC, Coetzee SG, Silva TC, Plummer JT, Reyes ALP, Davis BD, Chen SS, Lawrenson K, Lester J, Walsh C, Rimel BJ, Li AJ, Cass I, Berg Y, Govindavari JB, Rutgers JKL, Berman BP, Karlan BY, Gayther SA. DNA methylation and transcriptomic features are preserved throughout disease recurrence and chemoresistance in high grade serous ovarian cancers. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jul 27;41(1):232.
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